基于牛津纳米孔长读长测序的健康卢西塔诺纯种马眼表真菌组（Mycobiome）特征解析

《Animals》：Characterization of the Healthy Ocular Mycobiome of Purebred Lusitano Horses Using Oxford Nanopore Long-Read Sequencing

　　

摘要专业翻译 眼表（Ocular Surface）代表了一个独特的微生物生态系统，持续暴露于环境微生物之中；然而，健康马眼表真菌组分（Fungal Component）的特征仍未得到充分解析。本研究旨在利用牛津纳米孔长读长测序（Oxford Nanopore Long-Read Sequencing）与传统真菌培养法（Conventional Fungal Culture），对来自葡萄牙三个地理区域的12匹临床健康卢西塔诺纯种马（Purebred Lusitano Horses）的眼表真菌组进行表征，这些马匹饲养于两种不同的饲养系统（Housing Systems）中。测序结果显示出一个高度多样化的真菌群落，并呈现出显著的个体间变异性（Inter-individual Variability）。最丰富的菌属包括Wallemia、Podosphaera、Debaromyces、Aspergillus、Filobasidium、Kurtzmaniella、Metschnikowia、Malassezia及Spathaspora。真菌群落组成模式提示，局部环境条件可能对观察到的个体间变异性有所贡献。与马真菌性角膜炎（Equine Fungal Keratitis）相关的常见菌属，包括Aspergillus、Fusarium及Penicillium，在健康马匹中均有检出，且不受饲养系统影响。总体而言，健康马眼表以多样化的真菌组为特征，其中环境相关真菌占据主导地位。上述发现为未来研究眼部微生物失调（Ocular Microbial Dysbiosis）、真菌群落结构的环境决定因素以及马眼部健康提供了基线参考。

论文解读

一、研究背景与问题

眼表并非无菌环境，而是一个由细菌、真菌、病毒等多种微生物与宿主在动态生态平衡中共存的复杂微生态系统。在健康状态下，眼表微生物群通过宿主免疫系统互作及与潜在病原体的营养竞争，参与维持眼表稳态。尽管细菌是马眼表微生物群的主要组分，真菌亦被持续检出，构成所谓的眼表真菌组。该真菌群落被认为受到持续环境暴露的强烈影响，并与宿主免疫系统及常驻细菌群落存在交互作用。然而，与人类及部分动物物种相比，健康马眼表真菌组的特征长期未获充分解析。

既往针对马眼表真菌的研究大多依赖传统真菌培养技术。该方法仅能检出在实验室条件下可存活的真菌，因而对真菌多样性的呈现存在显著局限性。基于培养法的既往研究虽已从健康马眼中分离出Aspergillus、Penicillium、Cladosporium、Alternaria、Fusarium、Trichoderma、Scopulariopsis、Candida、Cryptococcus及Rhodotorula等菌属，但该技术对难培养或不可培养真菌的漏检问题始终存在。眼表真菌组的组成受多种环境与管理因素影响，包括地理位置、气候、季节、垫料、饲草及饲养条件。舍饲马可能较放牧马暴露于更多空气粉尘、干草及垫料相关真菌，而基于下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）的研究则报道放牧马真菌多样性高于舍饲马，提示环境暴露对真菌群落组成具有显著影响。此外，亦有研究未发现季节、气候、年龄、性别或品种对健康马真菌分离频率的显著影响，表明塑造马眼表真菌组的因素尚未完全阐明。

开展本研究的重要性在于：马相较于其他家养动物更易罹患真菌性角膜炎。角膜创伤、长期局部抗菌或糖皮质激素治疗以及局部眼表防御机制受损，均可促使眼表常在或环境来源的条件致病真菌转化为致病状态。由于导致马角膜炎的许多真菌病原体亦能从临床正常眼中分离，建立健康眼表真菌群落组成基线，对于区分共生或暂居真菌与疾病相关真菌、改进分子诊断结果的解读均至关重要。据研究人员所知，此前仅有一项研究采用NGS表征健康马眼表真菌组，且尚无针对卢西塔诺纯种马的相关研究。因此，本研究旨在利用牛津纳米孔长读长测序与传统培养法，对葡萄牙不同地理区域及饲养系统下临床健康卢西塔诺纯种马的眼表真菌组进行特征描述。

二、主要技术方法

研究人员从葡萄牙三个地理区域的种马场选取12匹临床健康卢西塔诺纯种马（8匹母马、4匹公马，年龄2至14岁），其中6匹放牧饲养、6匹舍饲。所有马匹均接受完整体格及眼科检查，符合纳入标准后，在镇静状态下使用eSwab采样拭子从下结膜穹窿采集结膜拭子样本。样本处理采用双轨策略：一方面进行传统真菌培养，接种于含氯霉素的沙堡弱葡萄糖琼脂培养基（Sabouraud Dextrose Agar, SDA），26℃有氧培养5至7天后依据宏观及微观形态学特征进行真菌鉴定；另一方面提取DNA后，针对真核生物细胞质大亚基核糖体RNA（LSU/28S rDNA）区域进行PCR扩增，利用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology, ONT）的Native Barcoding Kit 24 V14构建文库，在PromethION平台（R10.4.1流动池）上完成长读长测序。测序数据经质量过滤后，使用Kraken 2软件基于最低共同祖先（Lowest Common Ancestor, LCA）算法，参照NCBI GenBank真菌参考数据库进行物种分类注释。Alpha多样性采用Pielou均匀度指数评估，Beta多样性采用Bray-Curtis相异度指数并通过主坐标分析（Principal Coordinate Analysis, PCoA）可视化，组间差异以Kruskal-Wallis检验及Benjamini-Hochberg错误发现率（False Discovery Rate, FDR）校正进行统计评估。

三、研究结果

测序产出与质量评估：纳米孔PromethION测序经质量过滤（最低Phred评分≥7；读长1200至1700 bp）后，共产生1,351,576条高质量读段，其中1,233,664条被分类为真核生物来源。每个样本的真核读段数及操作分类单元（Operational Taxonomic Unit, OTU）数因样本及区域而异。

眼表真菌组Beta多样性：基于Bray-Curtis相异度的PCoA图显示，放牧马与舍饲马的点位存在部分重叠，表明真菌群落组成并未依据饲养系统形成清晰分离。尽管部分放牧马形成相对紧凑的聚类，但两个饲养组均表现出显著离散，提示个体间真菌群落组成存在实质性差异。

眼表真菌组Alpha多样性：采用Pielou均匀度指数评估群落内多样性。不同地理区域比较中，C区马匹真菌群落均匀度倾向高于A区及B区，但Kruskal-Wallis检验未检出显著差异；C区与B区比较未校正p值为0.0377，经FDR校正后q值为0.113，不再显著。饲养系统比较中，舍饲马中位Pielou值略高于放牧马，但差异未达统计学显著（p=0.0577），仅提示舍饲马真菌群落均匀度更高的趋势。当地理区域与饲养系统联合分析时，部分区域-饲养组合间检出经FDR校正后仍显著的差异（q<0.05），表明真菌群落均匀度受地理位置与饲养方式的联合效应影响。

物种丰富度与多样性：稀释曲线（Rarefaction Curves）显示，观测丰富度曲线在较低测序深度时快速上升后逐渐趋近渐近线，Shannon多样性曲线亦在相对较低测序深度达到稳定平台，表明当前测序深度已充分覆盖样本中的真菌群落，额外测序预期仅能回收少量新增分类群。

眼表真菌组组成：测序揭示出分类学上高度多样的真菌群落。单个样本含4至9个门、22至36个纲、60至92个目、133至222个科、209至435个属及264至842个OTU；全部样本合计鉴定出10个门、42个纲、118个目、306个科、703个属及1773个OTU。门水平上，子囊菌门（Ascomycota）与担子菌门（Basidiomycota）占主导，平均相对丰度分别为59.14±25.40%与36.12±26.35%，毛霉门（Mucoromycota）占4.39±6.16%，其余门丰度较低。按饲养系统分组时，子囊菌门在舍饲马中平均相对丰度更高（64.88±21.59%对比53.40±29.57%），而担子菌门与毛霉门在放牧马中更高（分别为40.27±32.36%与6.04±8.32%）。属水平上，最丰富的十个菌属为Wallemia、Podosphaera、Debaryomyces、Aspergillus、Filobasidium、Kurtzmaniella、Fusarium、Metschnikowia、Spathaspora及Malassezia，其相对丰度在个体间差异显著。按饲养系统分组时，Debaryomyces、Kurtzmaniella及Metschnikowia在舍饲马中平均相对丰度更高，而Wallemia、Podosphaera、Filobasidium、Aspergillus及Fusarium在放牧马中更高，但组内变异性较大。

传统真菌培养结果：共回收12个真菌属及3株未鉴定酵母分离物。Candida、Mucor及Aspergillus为最常鉴定菌属。传统培养回收的多个菌属（包括Aspergillus、Fusarium、Mucor及Candida）亦被纳米孔测序检出。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究提供了首个基于NGS的健康马眼表真菌组特征描述。结果揭示的高度多样性与显著个体间变异性，与既往研究将子囊菌门和担子菌门作为健康马眼表优势真菌组分的报道一致。与Walsh等人报道放牧马真菌丰富度、丰度及分类多样性显著高于舍饲马不同，本研究的多样性分析仅显示饲养条件对真菌群落结构的有限影响，提示饲养方式单独可能并非真菌多样性的主要决定因素，持续且共享的环境暴露或可部分解释饲养系统间差异有限的现象。尽管总体alpha多样性无显著差异，分类组成上存在差异：Wallemia在放牧马中主要关联Wallemia mellicola，舍饲马则同时携带Wallemia melicola与Wallemia hedeare；植物相关白粉病菌属Podosphaera在放牧马中占25.65±33.19%，远高于舍饲马的9.19±12.96%，但后者受一匹占比87.05%的放牧马数据偏斜影响。地理区域与饲养系统联合分析时检出显著效应（p=0.0039），且Beta多样性分析显示地理位置关联的真菌群落变异比例高于饲养方式，提示局部环境条件（气候、植被、土地利用及环境真菌储库）与管理实践交互塑造健康马眼表真菌组。与马真菌性角膜炎相关的Aspergillus、Fusarium及Penicillium在两种饲养系统的健康马中均有检出且相对丰度无显著差异，表明眼表存在潜在致病真菌并不足以导致疾病发生，真菌性角膜炎需角膜创伤、局部免疫防御受损、泪膜破坏等额外易感因素共同作用。NGS与传统培养法的有限一致性属预期结果，反映两种方法固有差异：培养法仅检出可培养活菌，NGS则通过遗传物质鉴定更广谱分类群，但无法区分活性定植与暂居或非活性真菌颗粒。研究人员亦承认样本量较小、未纳入环境对照样本、采样间隔可能影响培养回收等局限性，并建议未来开展更大队列、环境采样及跨季节纵向监测研究。

研究结论：本研究提供了葡萄牙卢西塔诺纯种马健康眼表真菌组的首个NGS表征。结果表明，马眼表栖息着以环境相关分类群为主导的多样化真菌群落。显著的个体间变异性与持续环境暴露对马眼表真菌群落的实质性影响一致。Wallemia sp.、Podosphaera sp.、Debaryomyces sp.、Fusarium sp.及Filobasidium sp.等分类群频繁检出，可能反映与空气颗粒、植被及环境储库的持续接触。饲养系统对真菌多样性影响有限，而地理位置对真菌群落组成变异的贡献更为显著；地理位置与饲养系统间的显著交互作用进一步支持局部环境条件在塑造健康马眼表真菌组中的重要性。上述发现为未来研究真菌性角膜炎及其他眼表疾病相关马眼表真菌组改变建立了重要基线，亦展示了长读长牛津纳米孔测序在全面表征健康马眼表真菌组中的价值。尽管NGS大幅扩展了真菌分类群的检出范围，传统培养法因能确认微生物活性、允许表型鉴定及抗真菌药敏试验而仍不可或缺，两种方法应视为互补而非互斥的技术手段。