HPV阳性女性宫颈脱落细胞中EBV感染及其基因整合特征分析

《International Journal of Women's Health》：Analysis of EBV Infection and Gene Integration in Cervical Exfoliated Cells from HPV-Positive Women

　　

目的：Epstein-Barr病毒（EBV）感染及其基因整合已在宫颈癌组织中被检出，但两者之间的关联尚未被证实。本研究采用高通量病毒整合检测方法，分析88例人乳头瘤病毒（HPV）阳性女性宫颈脱落细胞中EBV的感染及整合状态，探讨两者之间是否存在相关性。患者与方法：宫颈脱落细胞样本取自新疆医科大学附属肿瘤医院88例HPV阳性女性患者。液基细胞学检查由医院病理医师诊断，随后进行高通量检测以评估EBV和HPV的感染及整合情况。结果：研究人员发现，在HPV阳性女性的宫颈脱落细胞中，EBV检出率为34.09%（30/88）。多型HPV感染组（≥2种亚型）的EBV阳性率为31.65%（25/79），单一HPV亚型感染组为55.56%（5/9）。HPV16/18亚型感染样本中EBV感染率为41.86%（18/43），而无HPV16/18亚型感染样本中EBV感染率为26.67%（12/45）。根据2019年美国阴道镜和宫颈病理学会（ASCCP）指南，以五年内发生宫颈上皮内瘤变III级（CIN III）或更高级别病变的风险分组，正常组、低风险组和高风险组的EBV感染率分别为25.93%（7/27）、32.35%（11/34）和44.44%（12/27）。EBV自身整合最常见的位点位于蛋白编码区，而重复序列中的整合相对罕见。在HPV和EBV共感染病例中，HPV和EBV在整合事件及整合基因于宿主染色体上的分布方面表现出相关性。在高风险条件下，EBV整合数量、参与整合的基因以及差异表达基因均表现出显著差异。结论：EBV可能促进宫颈癌进展，但仍需进一步研究和实验验证。

论文解读：EBV在HPV阳性女性宫颈脱落细胞中的感染与基因整合特征

宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，虽然HPV疫苗的普及极大地推动了宫颈癌的预防，但早期筛查仍然是该疾病防控不可或缺的手段。高危型HPV感染已被明确与宫颈癌的发生密切相关，但并非所有感染高危型HPV的女性都会发展为宫颈癌，多数女性可依靠自身免疫清除病毒，仅少数进展为宫颈上皮内瘤变甚至宫颈癌。与此同时，部分宫颈癌患者的病变组织中并未检测到HPV，提示其他因素参与了宫颈癌变过程。EBV是一种人类疱疹病毒，含有双链线性DNA，自1964年被发现以来在人群中广泛流行。已有研究在宫颈癌组织和宫颈脱落细胞中检出EBV，也有证据表明EBV可经性传播。鉴于EBV在鼻咽癌、淋巴瘤及部分胃癌中具有致癌作用，研究人员推测EBV可能也在宫颈癌的发生和发展中起作用。病毒致癌涉及多种复杂机制，其中基因整合尤为重要。整合可导致宿主基因组不稳定，引发染色体倒位、易位、缺失和重排；病毒基因插入可沉默抑癌基因或激活原癌基因；整合还可改变宿主基因拷贝数，甚至形成具有致癌功能的融合基因。既往文献提示HPV和EBV可能共享类似的插入机制。近年来，以第二代测序为代表的高通量检测技术被广泛应用于病毒整合研究，使从基因水平探究病毒整合对疾病影响成为可能。

基于上述背景，研究人员从新疆医科大学附属肿瘤医院收集了100例HPV阳性患者的宫颈脱落细胞，排除新诊断但未接种HPV疫苗、无其他类型癌症、无免疫缺陷者，经样本质量评估后最终纳入88例（年龄23-72岁，中位47岁）。通过液基细胞学检测和HPV分型，研究人员利用高通量病毒芯片捕获测序技术，同时分析HPV和EBV的感染及其在宿主细胞中的整合特征。主要技术方法包括：采用流式杂交芯片法（HIVID）进行HPV检测；利用Ficoll淋巴细胞分离液进行密度梯度离心以去除淋巴细胞；提取DNA后进行琼脂糖凝胶电泳和Qubit定量检测；随后进行超声片段化、末端修复、3′端加A、接头连接、文库构建、杂交捕获、洗脱纯化及二代测序。该部分检测委托上海天昊生物科技有限公司完成。研究经新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。

研究结果显示，88例HPV阳性女性宫颈脱落细胞中，EBV检出率为34.09%（30/88）。HPV多型感染组的EBV感染率为31.65%（25/79），单一亚型感染组为55.56%（5/9），两组差异无统计学意义（χ2=2.056，P>0.05）。HPV16/18亚型感染组的EBV感染率为41.86%（18/43），无HPV16/18亚型感染组为26.67%（12/45），差异亦无统计学意义（χ2=2.259，P>0.05）。根据2019年ASCCP指南，以五年内发生CIN III或更高级别病变风险分层，正常组、低风险组和高风险组的EBV感染率分别为25.93%、32.35%和44.44%，三组间无显著统计学差异（χ2=2.135，P>0.05）。在EBV整合特征分析中，30份EBV阳性样本共检出148030次整合事件，涉及17908个基因。EBV整合广泛分布于包括线粒体基因在内的全部23条人类染色体，但分布不均，2号染色体整合事件最多（17223次），剔除线粒体基因后，21号染色体最少（1817次）。结合染色体长度比较，2号染色体的整合密度最高。共检测到109231个断点，涉及17908个基因，其中只有CADPS2基因（7q31.32）同时出现在4个样本中，78个基因在3个样本中同时出现，绝大多数基因仅在≤2个样本中被检出。整合断点位置分析显示，基因间区整合占比最高（49.99%），内含子区整合占38.49%，这与既往HPV整合常发生在基因富集区的模式一致。对高拷贝数断点基因（reads≥6）进行功能聚类，发现这些基因主要富集于转化生长因子激活、转录调节因子、核散斑和转化生长因子β受体活性等条目，KEGG通路富集于EBV感染、TGF-β信号和Notch信号通路。EBV自身基因断点分布分析显示，蛋白编码区的整合断点最为常见，而重复序列中的整合相对罕见。

在HPV和EBV共感染样本中，研究人员比较了共感染组和单一感染组的整合特征。30例共感染样本检出102258次HPV整合事件，58例单一HPV感染样本检出286864次整合事件。染色体分布组成比在两组间无显著差异（χ2=1.807，P>0.05），但共感染组和单一感染组的HPV整合事件染色体分布呈显著相关（R=0.987，P<0.001）。共感染组内部，HPV和EBV整合事件的染色体分布比也无显著差异（χ2=2.588，P>0.05），且两者显著相关（R=0.988，P<0.001）。类似地，整合基因的染色体分布也表现出相关模式。交集分析显示，共感染组HPV整合基因中93.36%（14869/15927）与EBV整合基因重叠，与单一感染组HPV整合基因重叠比例为86.08%（13710/15927），三组共同整合基因13219个（占共感染组HPV整合的83%），仅有491个基因是共感染组中HPV和EBV特有的整合基因（3.08%）。基于TCGA数据库对这些基因在宫颈癌与正常组织中进行差异表达分析，三组共同整合的13219个基因中有737个下调、876个上调，差异表达基因占7.66%；共感染组HPV与单一感染组HPV共整合的1650个基因中有62个下调、133个上调（11.82%）；共感染组HPV和EBV共整合的491个基因中有18个下调、36个上调（11%）；单一感染组HPV和EBV共整合的3185个基因中有112个下调、286个上调（12.5%）。GO和KEGG分析显示，不同基因集富集到不同生物学通路，如三组共同差异基因富集于肌肉系统过程、PI3K-Akt信号通路等；单一感染组HPV-EBV共整合差异基因富集于表皮发育等；共感染组HPV-EBV共整合差异基因富集于呼吸链复合体IV、帕金森病等。

根据ASCCP风险分层，研究人员进一步分析了不同风险条件下的EBV整合情况。正常组7例共感染样本中，EBV整合59次，涉及40个基因；低风险组11例样本中整合143次，涉及111个基因；高风险组12例样本中整合147828次，涉及17895个基因。基于TCGA数据库，筛选出在宫颈癌组织中差异表达的整合基因（|LogFC|>2，P.adj<0.05），正常组、低风险组和高风险组分别有3个、14个和2302个差异表达基因。有趣的是，正常组和低风险组的差异表达基因完全包含于高风险组之中。这些共同差异基因在高风险组中整合事件频率明显高于正常组和低风险组。

讨论部分，研究人员指出EBV感染率在HPV多型感染组和HPV16/18亚型感染组中更高，且随ASCCP风险分层升高而上升，尽管差异未达统计学意义，但考虑EBV基因组庞大、整合频率低，可能受样本量限制。EBV整合在PCEC中检测到的整合事件和基因数量高于既往在其他肿瘤细胞中的数据，可能得益于液相富集技术提高了灵敏度，而HPV整合导致的宿主基因组不稳定可能促进了EBV整合。EBV整合位点分布模式与HPV相似，支持两者存在共同机制。EBV高频整合可能仅是HPV导致基因组不稳定后的“搭便车”现象，也可能是相互促进的致癌驱动因素。本研究中未发现多个样本共同支持的高频断点基因，仅CADPS2在4个样本中检出，该基因与钙依赖分泌激活蛋白家族相关，可能与转移性乳腺癌治疗有关。功能富集显示整合基因涉及TGF-β和Notch等信号通路，其中LTBP1、HAS2-AS1、DDX10、E2F7、NCOR2、POLDIP3等基因已被证实与多种癌症相关，提示EBV整合可能改变这些潜在癌基因的表型。EBV自身断点主要位于蛋白编码区，意味着整合后形成的病毒-宿主融合基因可表达病毒蛋白，改变宿主表观遗传状态。EBV编码的LMP1和EBNA家族蛋白可与HPV E6/E7协同破坏基因组稳定性，驱动两种致癌病毒整合，并使EBV与HPV整合断点分布趋于一致。通过分组比较，单一HPV感染与共感染在整合事件和整合基因的染色体分布上无差异，但呈显著相关；共感染组中HPV和EBV整合的差异表达基因交集富集于宫颈癌相关通路，推测可能包含宫颈癌发生的关键驱动基因。最后，EBV整合在高风险组中数量更多、涉及基因更多、差异表达基因更多，提示EBV整合在宫颈癌进展中发挥重要作用。

本研究的结论为：EBV可能参与宫颈癌的发生发展过程；EBV和HPV在整合进入宿主细胞基因组时具有相似特征；EBV整合位点在宿主基因组中的染色体分布与HPV相关；共感染组中EBV整合可能激活部分宫颈癌中的原癌基因。研究首次分析了HPV感染宫颈脱落细胞中EBV的整合情况，但仅停留在DNA水平，未对整合基因进行转录和蛋白水平验证；生物信息学分析主要基于TCGA数据库，所得标志物仍需进一步实验验证。未来需要沿中心法则在多个层面深入研究两种病毒间的相互作用。