非经典雌激素受体GPR30在环境暴露水平玉米赤霉烯酮所致猪呼吸免疫毒性中的调控功能研究

《Environment International》：The regulatory function of the non-classical estrogen receptor GPR30 in porcine respiratory immunotoxicity induced by environmental exposure level of zearalenone

　　

玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEA）是由镰刀菌属真菌产生的具有雌激素活性的霉菌毒素，在饲料及食品中的检出率和超标率持续居高。本研究旨在探讨ZEA在特定饲料浓度阈值内是否能够通过雌激素受体对免疫系统产生雌激素效应及其呼吸免疫毒性机制。研究人员以猪肺泡巨噬细胞（Porcine Alveolar Macrophages, PAMs）细胞系3D4/21及中国巴马小型猪为模型，系统研究了ZEA与两种雌激素受体亚型——核雌激素受体α（Estrogen Receptor α, ERα）和非经典雌激素受体GPR30（亦称GPER）——在不同肺部微环境中的相互作用。体外实验结果表明，ZEA在生理条件下可诱导PAMs产生轻度氧化应激，且ZEA在PAMs中的雌激素受体作用靶点主要是GPR30而非ERα。选择性雌激素受体下调剂（Selective Estrogen Receptor Downregulators, SERDs）氟维司群（Fulvestrant）和艾拉司群（Elacestrant）虽能有效降解ERα，但未能一致性地缓解ZEA诱导的细胞毒性；而GPR30特异性拮抗剂G36则显著减轻了ZEA诱导的细胞毒性、细胞凋亡及促炎基因的上调。转录组学分析揭示ZEA通过IL-17信号通路和TNF信号通路诱导促炎效应。分子对接结果显示E2与ZEA对GPR30具有相近的结合亲和力。在动物实验中，研究人员建立了ZEA（饲料含量1000 μg/kg）经口暴露联合猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）感染的巴马小型猪模型。结果表明，ZEA单独暴露仅诱发轻度肺部炎症和氧化应激，未造成明显的肺组织病理损伤；但在PRRSV感染条件下，ZEA暴露加重了肺损伤并提高了病毒载量。尤为重要的是，GPR30拮抗后，ZEA在PRRSV感染期间过度激活了PERK介导的内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER Stress），加剧了PAMs凋亡和肺组织损伤，同时几乎全面下调了血清炎症细胞因子水平。综上，该研究表明ZEA的呼吸免疫毒性对GPR30的依赖性高于ERα，且GPR30的功能调控作用依赖于细胞微环境中的感染状态，为霉菌毒素与病原体共暴露的联合毒性机制提供了新的理论视角。

**论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

霉菌毒素作为真菌次级代谢产物，在全球范围内的污染和分布因气候变化而日益加剧。其中，由镰刀菌属产生的玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEA）在饲料和食品中的检出率及超标率居高不下——玉米及其副产品中ZEA暴露水平可达300–2000 μg/kg，甚至在啤酒和植物性膳食补充剂中也检测到接近1000 μg/kg的水平。ZEA经口摄入后主要经消化道吸收，因其亲脂性可迅速进入血液循环并分布至肝脏、肺脏和生殖器官等靶组织，在体内主要代谢为雌激素活性显著更强的α-玉米赤霉烯醇（α-Zearalenol, α-ZOL）。猪是对ZEA最敏感的动物物种，其胃肠道对ZEA的吸收效率高达80%–85%，且猪在基因表达及复杂表型遗传调控方面与人类具有相似性，因此被视为人类毒理学研究的可靠模型动物。

ZEA的雌激素样活性及其对生殖系统的毒性机制已被广泛研究，学界普遍认为核雌激素受体α（Estrogen Receptor α, ERα）是介导ZEA生殖毒性的主要靶点。然而，GPR30（亦称GPER）作为一种属于G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor, GPCR）超家族的七次跨膜受体，在结构、定位、信号转导机制和功能上与ERα存在显著差异，二者代表了雌激素发挥广泛生物学效应的两条主要且彼此独立的通路。GPR30与雌激素或雌激素样物质的关联是近年来研究的热点。已有研究表明，饲料和食品中低浓度的霉菌毒素虽不直接致病，但当与病原微生物共存时可产生免疫毒性效应，损害宿主防御机制并加速疾病进程。在猪群中，以猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）为代表的呼吸道传染病是重大公共卫生威胁，而猪肺泡巨噬细胞（Porcine Alveolar Macrophages, PAMs）在抵御此类病原入侵中发挥关键的固有免疫作用。鉴于ERα和GPR30在多个器官中的高表达及其在免疫细胞中日益明确的功能，ZEA是否能在特定饲料浓度阈值内通过这些受体对免疫系统发挥雌激素效应，是一个亟待解答的科学问题。该研究正是在此背景下开展，旨在探究ZEA与上述两种雌激素受体亚型在不同肺部微环境中相互作用所导致的呼吸免疫毒性，为霉菌毒素与病原体共暴露的联合毒性理论以及ZEA多系统毒性效应提供新的见解。该论文发表于*Environment International*。

**二、关键技术与方法概览**

研究人员采用猪肺泡巨噬细胞系3D4/21（ATCC来源，CRL-2843）进行体外实验，以17β-雌二醇（17β-Estradiol, E₂）作为ZEA雌激素活性的对照。主要技术方法包括：CCK-8法检测细胞活力并计算半数抑制浓度（IC₅₀），总NAD检测评估细胞代谢活性，流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）检测细胞凋亡，DCFH-DA探针检测细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平，Western Blot进行蛋白表达及亚细胞定位分析，qRT-PCR进行基因表达定量（采用Pfaffl法计算相对表达量），以及RNA测序转录组分析（基于Illumina测序平台，使用edgeR和DESeq2进行差异表达分析）。此外，利用ProTox-3.0在线平台预测ZEA和E₂的毒性终点（包括呼吸毒性、免疫毒性、ERα及ER-LBD通路毒性），通过AutoDock软件进行分子对接以评估配体-受体结合亲和力，并使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞内ZEA/E₂水平及动物血清炎症细胞因子。动物实验采用48头2月龄雌性中国巴马小型猪（SPF级，体重6±1 kg），随机分为对照组、ZEA暴露组（饲料含ZEA 1000 μg/kg）、氟维司群处理组、ZEA+氟维司群组、G36处理组及ZEA+G36组，实验第35天进行PRRSV高致病性毒株HUN/2022/F2攻毒（肌肉注射联合滴鼻，1×10⁵ TCID₅₀/mL），攻毒后第6天安乐死并采集血清、肺组织及肺灌洗液PAMs。肺组织经苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, HE）染色后进行病理学观察，血清及PAMs中PRRSV-N基因采用绝对定量qRT-PCR检测病毒载量。

**三、主要研究结果**

**3.1 ZEA与E₂的细胞毒性比较及毒性终点预测。** 体外实验中，E₂对3D4/21细胞的IC₅₀为344.6 μM，显著高于ZEA的22.78 μM，表明细胞对E₂的耐受性远高于ZEA。10 μM ZEA即可显著抑制细胞总NAD产生并诱导凋亡信号，而E₂需20 μM才产生类似效应。ProTox-3.0预测显示两种化合物在呼吸毒性、免疫毒性、临床毒性以及ERα/ER-LBD通路毒性方面均呈阳性，验证了研究的理论可行性。

**3.2 转录组学揭示ZEA的促炎效应。** KEGG通路富集分析表明，ZEA和E₂处理均显著富集IL-17信号通路（Ko04657）和TNF信号通路（Ko04668），qRT-PCR验证结果与组学数据一致，证实ZEA和E₂均可通过上述通路在3D4/21细胞中诱导炎症反应。

**3.3 ERα在ZEA诱导细胞毒性受体信号中的作用。** 3D4/21细胞中ERα主要表达于细胞质，细胞膜和细胞核表达较弱。两种SERDs——氟维司群（Fulvestrant, 10 nM）和艾拉司群（Elacestrant, 1 nM）——在安全剂量下均能有效降解ERα蛋白。然而，Elacestrant仅部分缓解E₂诱导的细胞毒性，对ZEA的调控效果不稳定；而氟维司群反而进一步加剧了ZEA和E₂诱导的细胞毒性，并使大多数ZEA诱导的差异表达基因进一步上调。

**3.4 GPR30是介导ZEA效应的主要受体。** 3D4/21细胞中GPR30主要分布于细胞质和细胞膜，细胞核中未见表达。氟维司群在降解ERα的同时可显著上调GPR30表达。分子对接结果显示，E₂与ERα的结合亲和力高于ZEA，而二者对GPR30的结合亲和力相近（结合自由能均<-7 kcal/mol）。GPR30特异性拮抗剂G36预处理显著减轻ZEA诱导的细胞毒性（但对E₂无效）和细胞凋亡，并广泛下调ZEA诱导的差异表达基因，其效果与氟维司群完全相反。ELISA检测显示G36可显著降低细胞内ZEA水平。

**3.5 ZEA和E₂通过GPR30诱导氧化应激进而触发炎症。** ZEA和E₂均可促进3D4/21细胞内ROS产生。G36预处理显著降低ZEA诱导的ROS水平，而氟维司群预处理反而增加E₂诱导的ROS。N-乙酰半胱氨酸（NAC, 10 mM）共处理可显著下调ZEA和E₂诱导的大多数差异表达基因，表明氧化应激是ZEA/E₂经GPR30触发炎症信号的关键中间环节。

**3.6 ZEA通过GPR30加剧PRRSV感染后仔猪肺损伤。** 在非感染期，ZEA暴露组与对照组体重增长无显著差异，肺组织HE染色仅见偶发性炎性细胞浸润，整体肺结构基本正常。PRRSV感染后，ZEA+PRRSV组较PRRSV组肺损伤更为严重，表现为间质出血、肺泡结缔组织增生、炎性浸润加剧以及肺泡壁增厚实变。ZEA+G36+PRRSV组肺损伤最为严重，出现广泛的肺泡壁上皮细胞脱落坏死和更显著的炎性浸润。Western Blot证实氟维司群在体内可有效降解PAMs中ERα，但GPR30未出现体外观察到的上调现象。

**3.7 ZEA扰乱动物感染前后炎症应答并提高感染后病毒载量。** 感染前，ZEA组血清促炎细胞因子IL-6、IFN-γ和TNF-α水平显著高于对照组。PRRSV感染后，ZEA+G36+PRRSV组较G36+PRRSV组IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α均显著下调。病毒载量方面，ZEA+PRRSV组肺组织中PRRSV-N基因表达显著高于PRRSV组；ZEA+G36+PRRSV组PAMs和肺组织中病毒载量均显著高于G36+PRRSV组，且ZEA+G36+PRRSV/G36+PRRSV的病毒载量比值显著高于ZEA+PRRSV/PRRSV。

**3.8 GPR30拮抗通过过度激活PERK介导的内质网应激加剧PRRSV感染后PAMs凋亡。** 流式细胞术结果显示，ZEA+G36+PRRSV组PAMs完全凋亡信号显著增加、正常细胞比例降低。Western Blot分析表明，该组Caspase3和Caspase9表达均显著升高，且PERK信号通路的磷酸化水平显著增强。值得注意的是，体外实验中ZEA作为单一因素并不能激活3D4/21细胞的PERK通路，提示ZEA诱导的内质网应激过度激活依赖于PRRSV感染这一特定微环境条件。

**四、讨论与结论**

本研究首次证实了ZEA的呼吸免疫毒性对GPR30的依赖性高于ERα，为ZEA呼吸道毒性机制提供了新的认知视角。在无病原体条件下，GPR30反应性地结合ZEA，通过氧化应激诱导细胞炎症和凋亡；而在PRRSV感染应激条件下，GPR30仅维持与ZEA的结合活性（无反应性激活），此时GPR30被拮抗后ZEA反而通过过度激活PERK介导的内质网应激通路加剧病毒诱导的细胞凋亡和肺损伤。这一发现揭示了ZEA暴露的危害不应仅以是否引起临床症状来评判——在饲料浓度水平下虽不直接致病，却可通过改变PAMs的固有免疫功能，在与病原体共暴露时显著恶化感染结局。

研究人员得出以下结论：ZEA的呼吸毒性对GPR30的依赖性高于ERα；未来ZEA毒性防控需要根据感染状态对GPR30进行动态的靶向调控，而非简单的阻断或激活。该领域目前存在两个关键局限：一是ZEA在未结合GPR30时加剧PRRSV感染的直接信号机制尚待阐明；二是尚未成功建立稳定的GPR30过表达动物模型。因此，未来研究需开发更精准的受体干预模型以深入探究该受体信号通路的机制。