《Food Microbiology》：High persistence of hepatitis A and E viruses during simulated gastrointestinal digestion across diverse food matrices
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甲型肝炎病毒（HAV）和戊型肝炎病毒（HEV）是全球范围内食源性病毒感染的主要病因。尽管已知这两种病毒均通过粪-口途径传播，但它们在通过人体胃肠道过程中的持久性，尤其是在不同食物基质存在下的持久性，仍缺乏充分研究。在本研究中，研究人员采用两种互补的体外消化
甲型肝炎病毒（HAV）和戊型肝炎病毒（HEV）是全球范围内食源性病毒感染的主要病因。尽管已知这两种病毒均通过粪-口途径传播，但它们在通过人体胃肠道过程中的持久性，尤其是在不同食物基质存在下的持久性，仍缺乏充分研究。在本研究中，研究人员采用两种互补的体外消化模型——即静态INFOGEST 2.0方案和动态TIM-1系统，模拟胃和小肠条件，评估了HAV和HEV的持久性。研究人员考察了与病毒传播相关的不同食物基质，包括浆果、牡蛎、生菜（HAV）和猪肝酱（HEV）。HAV感染性通过空斑试验（plaque assay）评估，而HAV和HEV基因组则经PMAxx预处理后通过反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进行定量。对于两种病毒，在所有测试基质和两种模型中，消化结束时的病毒水平均与初始浓度相当。尽管在特定时间点观察到微小变化，但这些变化不具有统计学显著性。总体而言，结果表明HAV和HEV在模拟胃肠条件下表现出高持久性，且受食物基质的影响有限。这些发现提示，决定病毒在消化过程中存活的并非基质依赖性保护作用，而是病毒固有的抗性，由此凸显了即便在低污染水平下消费者面临的潜在风险。本研究强调，在食品安全风险评估和控制策略中有必要更好地考虑病毒在消化过程中的持久性。
**论文解读**
**一、研究背景与问题提出**
食源性病毒感染是全球公共卫生领域的重大挑战，每年约有十分之一的人口罹患相关疾病。在众多食源性病毒中，甲型肝炎病毒（HAV，hepatitis A virus）和戊型肝炎病毒（HEV，hepatitis E virus）是最常通过污染食物和水引发暴发疫情的病原体。全球范围内，HAV每年导致约150万例有症状感染，而HEV每年感染人数估计超过300万。特定的食品类别与这两种病毒的传播密切相关：贝类（如牡蛎）可从污染水体中富集病毒，是HAV公认的主要传播媒介；新鲜农产品（包括浆果和叶菜）因受污染灌溉水或加工过程中不当操作而频繁引发疫情；HEV的传播则主要与食用未煮熟的猪肉或野味制品相关，尤其在高收入国家。这些传播载体在理化性质上差异显著，可能影响病毒在胃肠消化过程中的存活。
HAV以对环境应激因素（包括热、酸、冷冻和干燥）的高度抗性而著称，使其能够在食品加工和储存过程中持久存在。HEV长期以来被认为是发展中国家的地方性流行病，但近年来在高收入国家日益被视作人畜共患和食源性威胁。然而，关于胃肠消化如何影响这两种病毒的感染性，尤其是在不同食物基质存在下的影响，现有信息极为有限。HAV和HEV适应于经口途径感染人体，穿过肠道上皮进入血液并到达肝脏（其主要复制位点），随后通过胆汁分泌返回肠道，最终经粪便污染完成传播循环。因此，这两种病毒理应能够在相当程度上耐受胃肠道条件，但这一推测尚未在生理相关条件下得到实验证实。此外，胃肠道条件与不同食物基质之间的相互作用对病毒持久性的影响仍理解不足，构成了显著的知识空白。
**二、研究目的与总体设计**
本研究旨在探究HAV和HEV在模拟人体胃肠道条件下的持久性，同时考察食物基质（包括草莓、覆盆子、生菜、牡蛎和猪肝酱）对胃肠道应激条件的潜在保护效应及其对病毒持久性和感染性的影响。为此，研究人员采用了两种互补的体外消化模型：静态INFOGEST 2.0模型和动态TIM-1系统，以捕捉病毒行为的不同方面。静态模型允许在标准化条件下进行食物基质的受控比较评估，且兼容下游感染性检测；动态模型则通过再现渐变式转运、酶分泌、pH变化和区室化等过程，提供了更具生理相关性的人体消化模拟。
**三、关键技术方法概述**
研究人员使用FRhK-4恒河猴肾细胞培养HAV的致细胞病变株HM-175，使用A549细胞持续感染HEV基因3型株47832c以制备病毒储备液。新鲜草莓、覆盆子、生菜和猪肝酱购自本地商店，冷冻牡蛎（Crassostrea virginica，马格达伦群岛）由工业合作伙伴提供。实验设计根据每种病毒最相关的食物基质和每种消化模型可用的分析方法确定：HAV在静态INFOGEST模型中以水、草莓、覆盆子、生菜和牡蛎进行评估，感染性通过空斑试验定量；HAV在动态TIM-1模型中以水、覆盆子、生菜和牡蛎进行评估，采用PMAxx-RT-qPCR（PMAxx预处理反转录定量聚合酶链反应）评估病毒基因组持久性。HEV在两种模型中均以水和猪肝酱为基质，采用PMAxx-RT-qPCR评估其持久性，因为本实验条件下无法进行直接感染性评估。静态消化依据INFOGEST 2.0方案依次执行口腔相、胃相和肠相。动态消化使用TIM-1多腔室体外模型，模拟胃、十二指肠、空肠和回肠，动态控制pH、转运时间、酶分泌和蠕动运动。病毒RNA使用eGene-Up平台结合NucliSENS缓冲液和磁性硅胶进行半自动化提取，通过iTaq Universal探针一步法扩增试剂盒进行RT-qPCR定量。
**四、主要研究结果**
**4.1 HAV在静态体外消化中的持久性**
研究人员评估了四种食物基质中HAV在静态消化过程中的持久性，并与水对照进行比较。总体而言，大多数基质在各消化阶段之间未观察到感染性HAV滴度的显著差异。然而，草莓样本中感染性显著增加，平均滴度从胃相结束时的5.3 log PFU/mL上升至肠相结束时的6.5 log PFU/mL。研究认为，该增加很可能是静态消化模型的方法学局限：随着消化进行，食物基质结构崩解可能释放先前被截留的病毒颗粒，导致实测病毒载量表观升高。MTT细胞毒性分析证实，观察到的细胞毒性对各消化阶段的检测结果未产生影响。
**4.2 HAV在动态消化模拟系统中的持久性**
在TIM-1动态消化系统中，不同食物基质（水、覆盆子、生菜、牡蛎）之间以及胃腔室各时间点（0、60和90分钟）之间，HAV RNA水平均未观察到显著差异。在十二指肠中，牡蛎样本在30分钟和150分钟之间RNA水平存在显著差异（p = 0.0211）。在空肠中，覆盆子在150分钟和300分钟之间的RNA水平存在显著差异（p = 0.0300）。回肠中未观察到HAV RNA水平的显著变化。流出液样本、食糜样本和初始膳食样本中HAV RNA水平相近，表明所有病毒在消化条件下均持久存在。每小时收集的透析液中未检出病毒RNA，这与HAV颗粒（27-32 nm）过大而无法通过透析膜（截留分子量约10 kDa）的设计特性一致。
**4.3 HEV在静态体外消化中的持久性**
HEV在静态消化中的持久性通过PMAxx-RT-qPCR在水和猪肝酱中进行评估。在水中，与衣壳完整性得以保持的颗粒相关的HEV RNA在整个消化过程中均可检出。在肠相开始时（123分钟）观察到一个具有统计学显著性的降低，但该降低在最终肠相采样点（242分钟）未得到维持，因此被解释为瞬时变化而非持续性减少。在猪肝酱中，口腔相和胃相期间HEV RNA水平表观较低，肠相期间有所增加，该模式可能反映基质依赖性效应对病毒释放、RNA提取效率或RT-qPCR检测灵敏度的影响，而非病毒载量的实际增加。
**4.4 HEV在动态消化模拟系统中的持久性**
在TIM-1动态消化系统中，初始膳食和胃腔室100分钟时水和猪肝酱之间的HEV RNA水平存在显著差异（分别为p = 0.0418和p = 0.0132）。十二指肠和空肠中未观察到时间或食物基质的显著影响。回肠中，水样本在200分钟和360分钟之间HEV RNA水平存在显著差异（p = 0.0211），但各时间点不同基质之间无显著差异。最终食糜和流出液样本中的HEV RNA水平与原始膳食水平相近，证实病毒在消化条件下持久存在。由于猪肝酱膳食脂肪含量高，为避免膜污染和病毒颗粒人为损失，HEV动态消化实验未进行透析。
**五、讨论与结论**
综合静态和动态两种消化模型的结果，尽管两者在采样结构和分析读数上存在差异，但均支持同一总体结论：HAV和HEV在模拟胃肠条件下表现出高度持久性。在静态INFOGEST模型中，感染性HAV在所有测试基质的口腔相、胃相和肠相中均可检出，未出现一致的感染性降低。在动态TIM-1模型中，与衣壳完整性得以保持的颗粒相关的HAV RNA在胃和肠各腔室中持续可检出，仅存在有限且不一致的变化。HEV方面，与衣壳完整性得以保持的颗粒相关的RNA在静态和动态消化过程中均持续存在。
这些发现表明，与细菌性病原体不同——单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）等常在胃条件下部分失活——肠道病毒在消化过程中的存活可能较少受基质组成的影响，而更多取决于其固有的理化特性。HAV在低pH条件下的稳定性（在pH低至1.0时仍保持感染性）以及HEV可耐受pH 2至9范围长达3小时的能力，均为其在胃肠转运中存活提供了生物学基础。食物基质未表现出对两种病毒的一致保护效应，提示病毒的固有抗性而非基质依赖性保护决定了其在消化过程中的存活。
研究结论指出：HAV和HEV均能在模拟人体胃肠条件下持久存在，如静态（INFOGEST）和动态（TIM-1）体外模型所示。两种病毒在胃相和肠相中均可检出，且不受食物基质影响。这些发现提示病毒颗粒在消化过程中可能保持结构完整性，从而支持摄入后发生传播的可能性，这凸显了对生食或最低限度加工的高风险食品采取严格食品安全措施的重要性。
本研究存在若干局限性，包括未针对每种食物基质和消化阶段进行基质特异性回收对照，以及PMAxx-RT-qPCR未在各消化基质中采用成对的完整和灭活病毒对照进行独立验证。因此PMAxx结果应解释为结构完整颗粒内病毒基因组保护程度的指示，而非感染性的确凿证据。此外，TIM-1系统因工作体积大和样本稀释问题，无法对HAV进行空斑试验定量。尽管如此，两种模型得出的结论具有一致性，强化了病毒在消化过程中高度持久的核心发现，对食品安全风险评估具有重要意义。
