《Food Research International》：Identification of food-grade photosensitizers using 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein for photodynamic inactivation of spoilage microorganisms on baby spinach
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**专业术语翻译摘要**
食物损耗与浪费是最紧迫的可持续性挑战之一，全球每年有超过三分之一的食物产量被损耗或浪费，给环境、经济和粮食安全带来沉重负担。在所有食物类别中，水果和蔬菜按重量计占食物浪费的最大份额（44%），其中绿叶蔬菜尤其脆弱，约占食物浪费总量的2
**专业术语翻译摘要**
食物损耗与浪费是最紧迫的可持续性挑战之一，全球每年有超过三分之一的食物产量被损耗或浪费，给环境、经济和粮食安全带来沉重负担。在所有食物类别中，水果和蔬菜按重量计占食物浪费的最大份额（44%），其中绿叶蔬菜尤其脆弱，约占食物浪费总量的28%，且高达90%的丢弃是由于腐败变质。食物变质主要由微生物生长及相关酶活性驱动，这会损害质地、颜色、风味和营养品质，最终使产品无法被消费者接受。因此，迫切需要适用于整个供应链的有效且持久的保鲜策略。目前，氯、过氧乙酸和过氧化氢是农产品洗涤水中最广泛使用的化学消毒剂，但其抗菌效果常常受环境条件和固有化学局限性的影响。此外，对健康风险、运营成本、异味产生及法规限制的担忧进一步限制了其实际应用。
抗菌光动力灭活（antimicrobial photodynamic inactivation, aPDI）已成为一种有前景的非热微生物控制替代技术，因其诱导抗菌耐药性的风险低，且符合“清洁标签”加工趋势。该技术依赖于光、氧气和光敏剂（photosensitizers, PSs）的相互作用产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），对细菌、真菌、病毒和原生动物具有广谱抗菌活性。其涉及的光化学反应迅速、产生热量极低、且不施加机械应力，使aPDI特别适用于绿叶蔬菜等娇嫩农产品。光基抗菌处理已显示出在绿叶蔬菜（如芥兰、生菜、小白菜和菠菜叶）中控制微生物和保持品质的潜力。然而，以往的研究主要集中在有限的处理系统，反映出目前可用于食品领域的光敏剂仍未得到充分探索。大多数候选物源自为光动力治疗（photodynamic therapy, PDT）开发的药物，食品级光敏剂主要局限于由紫到蓝光（400–490 nm）激活的天然酚类化合物，绿到红光谱范围内有效的相对较少。扩大食品级光敏剂的光谱多样性，将能够实现颜色匹配策略，在保持处理农产品外观的同时，为不同光照环境提供实际灵活性。
光敏剂发现的主要瓶颈在于依赖劳动密集、低通量的筛选方法。常规ROS检测方法，如电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance, EPR）、高效液相色谱-质谱联用（high-performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS）以及基于荧光或化学发光的化学测定法，通常需要大样本量、复杂的实验装置、专业仪器和大量的数据处理。此外，许多化学探针针对特定ROS具有选择性，且易受外部刺激产生假象，限制了其在一般光活性筛选中的适用性。2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH2-DA）被广泛用作细胞内氧化应激检测探针，并展现出作为光敏剂筛选通用工具的相当潜力。在细胞摄取后，DCFH2-DA被酯酶脱乙酰化形成2′,7′-二氯二氢荧光素（DCFH2），其可与多种ROS反应，包括羟基自由基（HO•）、单线态氧（1O2）、在Fe2+存在下的过氧化氢（H2O2）以及（间接地）超氧阴离子（O2•?）等。这些ROS是光动力过程中产生的主要细胞毒性物质，直接负责微生物灭活。虽然DCFH2已广泛用于细胞系统研究抗菌机制，但其在无细胞系统中用于光敏剂筛选的应用仍 largely 未被探索。
在本研究中，研究人员提出了一种集成的筛选到应用的工作流程，结合基于DCFH2的荧光筛选、抗菌验证和鲜农产品保鲜研究，以识别和评估用于aPDI应用的食品级光敏剂。具体而言，合成了高纯度DCFH2，并以Fenton反应作为生物学相关、可重复的ROS产生参考系统，系统表征了其在受控条件下的荧光响应。优化了该测定方法以减少着色剂诱导的光学干扰和背景噪声，并支持食品着色剂在跨光谱范围内的半定量ROS相关氧化响应比较。随后，在蓝、绿、红可见光谱范围内筛选了九种FDA批准的食品着色剂。为减轻光谱重叠或探针假象引起的假阳性结果，纳入抗菌药敏试验和杀菌试验作为生物学验证步骤，以区分基于荧光的活性和抗菌性能。然后，在baby spinach（一种高度易腐的绿叶蔬菜模型）上评估选定的食品级光敏剂，在14天冷藏期间检查受控条件下鉴定的光活性如何转化到复杂的叶片表面。这项工作的主要贡献是：（1）开发和验证了一个快速、高通量的基于DCFH2的平台，用于可见光谱范围内食品级光敏剂的比较评估；（2）确定姜黄素（curcumin, CUR）、赤藓红B（erythrosin B, EB）和叶绿素铜钠盐（chlorophyllin, CCS）为有效的食品级光敏剂，对革兰氏阳性和革兰氏阴性腐败细菌均具有LED光激活的抗菌特性；（3）证明aPDI性能在从受控体外系统转化到绿叶蔬菜食品基质过程中的显著变化，同时表明选定的着色剂介导的aPDI处理可以在冷藏期间减少细菌种群并维持关键品质属性。这些发现强调了处理环境和食品表面特性在影响实际抗菌功效中的重要性。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
食物损耗与浪费是当前全球可持续性挑战的核心问题之一。据统计，全球每年有超过三分之一的食物产量被损耗或浪费，其中水果和蔬菜按重量计占食物浪费的最大份额，高达44%。绿叶蔬菜尤其脆弱，约占总食物浪费量的28%，且高达90%的丢弃归因于腐败变质。微生物生长及其伴随的酶活性是导致农产品腐败、品质劣变和消费者接受度下降的主要驱动因素。目前，氯、过氧乙酸和过氧化氢等化学消毒剂是农产品洗涤水中最广泛使用的杀菌剂，但其抗菌效果受环境条件和化学性质限制，且存在健康风险、运营成本高、异味产生和法规限制等弊端。
抗菌光动力灭活（aPDI）技术因其低耐药性风险和符合“清洁标签”加工趋势而受到关注。该技术利用光、氧气和光敏剂（PSs）相互作用产生活性氧（ROS），对各类微生物具有广谱杀灭效果。然而，当前适用于食品领域的光敏剂开发严重不足。大多数候选物源自光动力治疗（PDT）药物，而食品级光敏剂主要限于由紫至蓝光（400–490 nm）激活的天然酚类化合物，在绿至红光范围内的有效种类很少。这种光谱多样性限制不利于实施颜色匹配策略以保持农产品外观，并制约了不同光照环境下的应用灵活性。此外，光敏剂发现过程中的一个主要瓶颈是依赖劳动密集、低通量的筛选方法。现有的ROS检测技术，如电子顺磁共振（EPR）、高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）等，通常需要大型样本量、复杂设备与数据处理，限制了快速筛选效率。因此，亟需开发一种快速、高通量且适用于无细胞体系的筛选平台，以识别更多光谱多样化的食品级光敏剂。
**研究内容与结论**
针对上述问题，研究人员开发了一种集成的“筛选到应用”（screening-to-application）工作流程，结合基于2′,7′-二氯二氢荧光素（DCFH2）的荧光筛选、抗菌验证和鲜切农产品保鲜实验，系统评估食品级着色剂的光动力活性。研究合成了高纯度DCFH2探针，并以Fenton反应作为可控且生物学相关的ROS产生参考系统，系统优化了Fe浓度、磷酸盐浓度、pH和温度等关键参数。随后，对九种美国FDA批准的食品着色剂在蓝、绿、红可见光谱范围内进行筛选。为排除假阳性结果，研究人员引入了抗菌药敏试验作为生物学验证步骤。最终，选定的光敏剂被应用于baby spinach叶片表面，通过14天冷藏期间的品质监测，评估其在实际食品基质中的保鲜潜力。
研究得出以下主要结论：第一，成功建立了基于DCFH2的快速、高通量筛选平台，能够比较评估可见光谱范围内的食品级光敏剂；第二，姜黄素（CUR）、赤藓红B（EB）和叶绿素铜钠盐（CCS）被鉴定为有效的食品级光敏剂，对革兰氏阳性菌蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和革兰氏阴性菌荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）均表现出LED光激活的抗菌活性；第三，aPDI性能在从受控的体外系统转化到绿叶蔬菜食品基质时发生显著变化，但选定的着色剂介导的aPDI处理仍能在冷藏期间有效减少细菌种群并维持关键品质属性。这些发现强调了处理环境和食品表面特性对实际抗菌功效的重要影响。
**关键技术与方法**
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，通过碱性水解法从DCFH2-DA前体合成高纯度DCFH2探针，并利用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和电喷雾电离飞行时间质谱（ESI-TOF-MS）进行表征验证。其次，以Fenton反应作为羟基自由基（HO•）的受控来源，优化了pH 6、Fe浓度10 μM、温度37 ℃和低磷酸盐浓度（<10 μM）的最优检测条件，实现了DCFH2荧光信号的半定量分析。再次，使用配备可切换LED光源（蓝光410–447 nm、绿光492–565 nm、红光622–656 nm）的光照箱进行光敏剂筛选和抗菌实验。最后，在baby spinach模型上开展了微生物灭活实验和为期14天的冷藏保鲜实验，通过质地分析、CIELAB颜色测量和总活菌计数评估保鲜效果。baby spinach样本购自新西兰当地超市（Woolworths）。
**研究结果**
**DCFH2的合成与表征。** 研究人员通过UV-Vis吸收光谱、荧光光谱和质谱分析证实了DCFH2的成功合成。DCFH2-DA脱乙酰化后主吸收峰从265 nm移至约288 nm，且在约525 nm处无DCF特征吸收峰，表明产物纯度高且未发生明显氧化。荧光光谱显示，只有氧化形式的DCF在485 nm激发下于530 nm处产生强发射，而DCFH2-DA和DCFH2均无可检测荧光。ESI-TOF-MS分析进一步确证了产物身份，主离子峰位于m/z = 400.99，具有二氯代物种的氯同位素特征，且未检出前体离子峰，证实DCFH2-DA完全脱乙酰化，产物具有高化学纯度。
**DCFH2-Fenton测定法的优化。** 在Milli-Q水中，10 μM Fe浓度下荧光强度与H2O2浓度（0–100 μM）呈最强线性相关（24小时内R2≥0.99）。磷酸盐缓冲液（PBS）显著抑制荧光响应，100 μM磷酸盐使信号明显衰减。pH优化表明，pH 6时荧光响应最佳，而pH 3时由于DCF形成非荧光内酯形式及氯离子竞争反应导致信号与H2O2浓度无关。温度实验显示，37 ℃比25 ℃产生更快且更高的荧光强度，因此选择37 ℃作为标准反应温度。
**食品着色剂的光活性筛选。** 通过DCFH2测定法，研究人员鉴定出六种具有光活性的着色剂：CUR、TAR、BC、AR、EB和CCS。其中，EB在20 μM浓度下产生最高的ROS输出，超过100 μM H2O2 Fenton参考值的19倍以上；AR和CCS次之。浓度依赖性实验揭示了聚集诱导猝灭（ACQ）现象，EB在20 μM以上、CUR在40 μM以上均出现ROS产生下降。对照实验确认了LED照射本身不会显著加速DCFH2自氧化，且蓝色光下DCF的光漂白可能导致蓝光激活着色剂的ROS产生被低估。
**着色剂的抗菌活性验证。** 纸片扩散药敏试验显示，蜡状芽孢杆菌对BC、CUR、EB和CCS敏感，其中EB产生的抑菌圈最大；荧光假单胞菌仅对EB和CCS敏感，反映了革兰氏阴性菌外膜屏障功能。TAR和AR尽管在DCFH2测定中呈阳性，但未表现出抑菌活性，说明化学ROS测定单独不足以确认aPDI功效，生物学验证是必要的二级筛选手段。液态杀菌试验中，在Milli-Q水中，CUR、EB和CCS对蜡状芽孢杆菌均实现约4–5 log的灭活；在PBS中，EB在>5 μM时达到完全灭活（>5 log），CCS在>20 μM时达到相同效果。荧光假单胞菌对所有处理均表现出更强抗性，CUR在20 μM时达到最大约4 log灭活，EB在≥20 μM时实现完全灭活，而CCS即使在1000 μM下也未显示可检测的抗菌活性。
**baby spinach表面应用。** 在接种蜡状芽孢杆菌的菠菜叶片上，CUR和EB喷洒结合LED照射实现了超过4 log CFU/cm2的灭活效果，而CCS仅产生约1.2 log的减少。值得注意的是，仅蓝光照射对照（P?L+）也产生了约3 log的蜡状芽孢杆菌灭活，归因于细菌内源性卟啉的光激活。对于荧光假单胞菌，仅EB处理产生了显著灭活（5.5降至4.4 log CFU/cm2）。叶片表面效果低于体外系统的原因包括叶片表面疏水性导致液滴珠化而非均匀铺展、细菌优先定殖于气孔和 crevices 区域与着色剂液滴空间分离、以及叶片内源性抗氧化剂对ROS的淬灭作用。
**baby spinach保鲜研究。** 在14天冷藏期间，未处理对照组从第6天起出现明显腐败迹象，至第14天叶片软化、黄化并形成粘性生物膜。所有aPDI处理组在整个储存期间均保持可接受的外观。第14天总活菌计数显示，CUR、EB和CCS处理组的活菌数分别比对照组减少了72.95%、70.14%和81.32%。质地分析表明，aPDI处理未损害叶片完整性与脆裂强度。CIELAB颜色测量显示，处理组与对照组的色差（ΔE2000）始终低于感知阈值2，消费者难以察觉视觉差异。主成分分析（PCA）显示，处理组和对照组在质地与颜色指标上没有明显的聚类分离，进一步证实aPDI处理不会导致可检测的品质劣变。
**讨论与结论总结**
在讨论部分，研究人员指出aPDI功效受多种因素制约，包括光敏剂自身理化性质、细菌细胞膜结构差异、处理介质离子组成以及食品表面的复杂微观结构。着色剂的空间分布与局部浓度是决定实际抗菌效果的关键因素，叶片表面疏水性和不平整性限制了光敏剂与细菌的有效接触。此外，肠道内源性抗氧化物质可能淬灭ROS，削弱处理效果。研究人员建议在未来的工作中研究表面活性剂或替代施用策略以改善光敏剂在疏水表面的铺展性和接触效率。
研究结论表明，本研究成功建立了一个集成的筛选到应用工作流程，用于识别和评估用于LED光激活微生物灭活的食品级着色剂。合成的DCFH2探针被验证为量化ROS产生的灵敏工具，并以Fenton系统作为参考实现了跨可见光谱范围食品着色剂ROS产生能力的直接比较。结合抗菌药敏试验的双重验证策略，研究从九种着色剂中鉴定出赤藓红B、叶绿素铜钠盐和姜黄素为最有效的光敏剂。在30分钟绿光LED照射下，20 μM赤藓红B产生的DCFH2荧光响应约为100 μM H2O2 Fenton参考值的20倍。这三种着色剂显著降低了蜡状芽孢杆菌的活性，照射30分钟后减少量接近或超过5个log。赤藓红B和姜黄素对更具抗性的荧光假单胞菌也有效，分别实现约5和4 log的减少。aPDI功效受着色剂性质、细菌膜结构和处理介质离子组成的强烈影响。在baby spinach食物模型中，着色剂介导的处理在14天内将细菌种群减少了70.14%–81.32%，同时保持了质地、颜色和整体外观。研究结果证实aPDI是一种有前景的食品安全、非热且可持续的保鲜策略，有助于减少食物腐败和采后损失。
