多平台表征揭示帕尔马干腌猪腹肉（Pancetta Piacentina PDO）240天成熟过程中生化与感官的演变

《Food Research International》：A multi-platform characterization reveals the biochemical and sensory evolution of pancetta Piacentina PDO throughout 240?days of ripening

　　

： “Pancetta Piacentina”是一种传统意大利干腌肉制品，根据欧盟委员会条例（EC）第1263/96号获得受保护原产地命名（PDO）地位。该研究旨在通过结合常规成分分析、脂肪酸谱、氧化还原标志物、非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）、脂质组学（lipidomics）、挥发性物质谱及感官分析的多平台方法，全面表征Pancetta Piacentina PDO在0至240天成熟过程中的生化与感官演变。研究人员对30个独立生物学样本（每个成熟时间点6个，即T0、T60、T120、T180和T240）进行了分析。结果表明，成熟过程伴随水分持续流失、蛋白质含量相对增加、灰分及NaCl含量显著上升，而总脂质含量保持相对稳定。脂肪酸谱显示多不饱和脂肪酸（PUFA）相对比例显著下降（从T0的12.30%降至成熟样本的8.86%–10.18%），饱和脂肪酸（SFA）相对比例上升，单不饱和脂肪酸（MUFA）基本稳定。氧化还原标志物显示过氧化值在T120达到峰值（20.9 mEq O?/kg脂肪），硫代巴比妥酸反应物（TBARS）在T60和T120升高后于T240回落至接近初始水平；谷胱甘肽（GSH）含量急剧下降，GSH:GSSG比值从T0的152.8降至成熟阶段的5.0–19.5，表明内源性抗氧化系统发生显著改变。非靶向代谢组学共注释2316个特征，其中83个代谢物达到MSI Level 2注释水平，揭示了蛋白质水解（如二肽积累）、脂质重塑与氧化、以及可能源于香料和微生物代谢的转化。脂质组学注释了113个MSI Level 2脂质种类，显示脂肪酸酰基、甘油酯、鞘脂、异戊二烯脂和固醇脂类水平总体上升，而甘油磷脂在成熟后期相对减少。通过DIABLO框架对代谢组学和脂质组学进行正式整合，识别出与成熟阶段区分相关的分子特征组合，包括与蛋白水解相关的肽类（如天冬氨酰-色氨酸）、N-酰基甘氨酸、肉碱和鞘磷脂等。挥发性物质谱鉴定出59种挥发性有机化合物，其中支链酯类如2-甲基丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯在后期成熟阶段显著增加。感官分析显示，随着成熟时间延长，鲜肉香气降低，融化性和黄油香气增强，而哈败味保持适中。综上所述，Pancetta Piacentina PDO的成熟是脂质氧化、蛋白质水解和广泛代谢重塑共同作用的结果，而非单一分子特征的变化；所识别的分子特征可作为技术成熟度、真实性或质量的潜在候选指标，但需在独立样本和不同生产条件下进一步验证。

论文解读文章：

一、研究背景与目的

Pancetta Piacentina是意大利传统干腌肉制品，依据欧盟委员会条例（EC）第1263/96号获得受保护原产地命名（PDO）地位，由重猪猪腹肉经干盐腌制、卷制、捆扎，并在受控温湿度条件下成熟至少四个月制成。成熟过程中，脱水、蛋白质水解、脂质水解和氧化反应共同塑造最终产品的理化、生化及感官特性。脂质代谢在干腌肉制品的风味形成中发挥核心作用：脂质水解释放游离脂肪酸，作为挥发性及非挥发性风味化合物的前体，同时为氧化反应提供底物。猪腹肉制品因脂肪含量高而特别容易发生氧化。尽管已有研究对干腌肉制品的代谢组学或脂质组学进行单独表征，但对PDO干腌肉制品（尤其是Pancetta Piacentina PDO）的整合代谢组学-脂质组学研究仍然有限。现有研究主要集中于微生物表征等特定方面，而成熟过程背后的分子机制及其与感官和香气发展的关系尚未得到充分阐明。因此，该研究旨在通过多平台分析策略，结合常规成分分析、脂肪酸谱、氧化还原标志物、非靶向代谢组学、脂质组学、挥发性物质谱和感官分析，全面表征Pancetta Piacentina PDO的成熟过程，并利用DIABLO框架对代谢组学和脂质组学数据进行正式多元整合，以识别有助于区分成熟阶段的分子特征。

二、研究内容与主要结论

研究人员收集了来自意大利Salumificio Giordano（属于“Salumi Piacentini PDO Consortium”）的Pancetta Piacentina PDO样本，涵盖5个成熟时间点（T0新鲜未处理猪腹肉、T60、T120、T180、T240），每个时间点6个独立生物学样本，共30个样本，每个样本来自不同动物并代表独立生物学单元。研究发现，成熟过程中水分含量从T0的40.2 g/100g降至T240的30.5 g/100g，蛋白质含量增加至T180的18.4 g/100g，灰分从0.6 g/100g增至4 g/100g以上，NaCl含量从0.09 g/100g升至约2–3 g/100g，而总脂质含量保持相对稳定（约45–50 g/100g）。脂肪酸谱显示MUFA（以油酸C18:1n9c为主，约44%）占主导且基本稳定，PUFA相对比例从T0的12.30%显著降至成熟样本的8.86%–10.18%，SFA相对比例从T0的38.04%升至T120–T180的40%以上。氧化还原标志物显示过氧化值从T0的1.7 mEq O?/kg脂肪升至T120的20.9峰值后回落，TBARS在T60和T120升高（1.4和1.3 mg MDA/kg DM）后于T240降至0.8 mg MDA/kg DM（与T0无显著差异），GSH从225.6 mg/kg DM急剧降至成熟阶段的10.9–34.1 mg/kg DM，GSSG在T60升至7.7 mg/kg DM后逐步下降，GSH:GSSG比值从152.8降至5.0–19.5。代谢组学揭示了蛋白质水解（二肽如L-脯氨酰-L-苯丙氨酸、丙氨酰色氨酸等积累）、脂质重塑与氧化（如羟基化脂肪酸、溶血磷脂、氧化固醇类）、以及可能源于香料（如异胡椒碱）和微生物代谢的转化。脂质组学显示脂肪酸酰基、甘油酯、鞘脂、异戊二烯脂和固醇脂类水平总体上升，而甘油磷脂在T180和T240相对减少。DIABLO整合分析识别出与成熟阶段区分相关的代谢物-脂质组合，包括蛋白水解相关肽类（天冬氨酰-色氨酸、天冬酰胺酰-γ-谷氨酸、N-γ-L-谷氨酰-L-缬氨酸）、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-酰基甘氨酸（NAGly 22:5、NAGly 22:4、NAGly 20:1）、肉碱（CAR 16:0、CAR 16:2）和鞘磷脂（SM 27:6;2O）等。挥发性物质谱鉴定59种化合物，其中2-甲基丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯在后期成熟阶段显著增加。感官分析显示T60具有较高鲜肉香气和咀嚼性，延长成熟增加融化性、黄油香气和轻微苦味、涩味，哈败味保持适中。

三、主要技术方法

该研究采用了多平台分析策略，主要包括：常规成分分析（水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分按ISO和AOAC方法测定）和矿物元素分析（微波消解后采用电感耦合等离子体发射光谱法ICP-OES测定Na、Cu、Fe、Zn，电感耦合等离子体质谱法ICP-MS测定Se）；脂肪酸谱采用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）分析脂肪酸甲酯（FAME）；氧化还原标志物包括过氧化值（AOAC 965.33）、硫代巴比妥酸反应物（TBARS）和谷胱甘肽系统（GSH、GSSG，通过UHPLC-HRMS半定量）；非靶向代谢组学和脂质组学均采用超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS，Orbitrap Exploris 120），分别在正离子模式下全扫描采集，代谢组学注释基于FooDB和自建谱库，脂质组学注释基于LIPIDBLAST自建库，注释遵循代谢组学标准倡议（MSI）建议；挥发性物质采用顶空固相微萃取（SPME）结合全二维气相色谱-质谱（GC×GC-MS）分析；感官分析采用定量描述性分析（QDA），由12名经培训的评审员按ISO 13299在ISO 8589:2007合规感官实验室进行；统计分析和数据整合采用R 4.4.1、MetaboAnalyst 6.0和mixOmics（DIABLO框架）。样本来自意大利Salumificio Giordano（Carpaneto Piacentino, Piacenza），猪腹肉由Martelli F.lli S.p.A.（Dosolo）供应，源自同一农场、同一基因型猪只并在同一屠宰场屠宰。

四、研究结果

4.1 Pancetta Piacentina PDO样本的常规成分和矿物组成

常规成分分析显示，成熟过程中水分含量从T0的40.2 g/100g持续下降至T240的30.5 g/100g，反映腌制和干燥过程中的水分流失。蛋白质含量在T180达到18.4 g/100g后略有下降，主要归因于脱水和含氮化合物的浓缩。总脂质含量保持相对稳定（约45–50 g/100g），尽管脂肪酸谱、氧化标志物和脂质组学记录了广泛的定性变化。灰分从T0的0.6 g/100g显著增至成熟后期的4 g/100g以上，与盐分渗透和扩散一致。NaCl含量从新鲜肉的0.09 g/100g升至成熟样本的约2–3 g/100g，T180达到最高值。矿物元素中，Cu、Fe、Se在整个成熟过程中无显著变化，Zn逐步增加至T180后于T240下降。

4.2 成熟过程中脂肪酸谱的修饰

GC-FID分析显示，脂质部分以MUFA为主（约50%），其次为SFA（约38–41%）和PUFA（约9–12%）。油酸（C18:1n9c）是最丰富的脂肪酸（约44%），在整个成熟过程中无显著变化。棕榈酸（C16:0）相对比例在T120和T180显著升高。PUFA相对比例从T0的12.30%显著降至成熟样本的8.86%–10.18%，其中亚油酸（C18:2n6c）从10.71%降至7.72%–8.85%，多种长链PUFA（C20:2、C20:3n6、C20:3n3、C22:5n3、C22:6n3）也显著下降。SFA相对比例从T0的38.04%升至T120–T180的40%以上，MUFA保持相对稳定。

4.3 氧化还原标志物（TBARS、过氧化物、GSH:GSSG比值）的演变

过氧化值从T0的1.7 mEq O?/kg脂肪显著升至T60的11.8，T120达到峰值20.9，随后在T180和T240下降。TBARS从T0的0.6 mg MDA/kg DM升至T60的1.4和T120的1.3，T240降至0.8（与T0无显著差异）。GSH从T0的225.6 mg/kg DM急剧降至T60的34.1和T240的10.9，所有成熟阶段显著低于T0。GSSG从T0的1.6 mg/kg DM升至T60的7.7峰值后逐步降至T240的0.6。GSH:GSSG比值从T0的152.8降至T60的5.0，随后数值上升至T180–T240的约19.5，但所有成熟阶段仍显著低于T0。

4.4 代谢组学和脂质组学整合评估生化修饰

4.4.1 非靶向代谢组学

UHPLC-HRMS代谢组学在质量过滤后注释了2316个特征，其中83个代谢物达到MSI Level 2注释水平。氨基酸、肽类及类似物是最大化学类别（255个特征）。主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）清晰区分了新鲜样本和成熟样本，sPLS-DA显示T0、T60和T120–T240三个主要代谢簇。OPLS-DA模型比较各成熟阶段与T0，T60 vs T0获得458个判别代谢物，T120、T180和T240 vs T0分别获得513、539和582个判别代谢物。MS/MS支持的Level 2代谢物显示二肽（如L-脯氨酰-L-苯丙氨酸、丙氨酰色氨酸、天冬酰胺酰-γ-谷氨酸）在成熟过程中持续变化，表明低分子量含氮组分的持续重塑。异胡椒碱（isopiperine）从T120起持续高VIP积累，可能源于加工中使用的香料。甜菜碱（betaine）在T240 vs T0中独特判别且显著下降（log?FC=?3.48）。同型谷胱甘肽（homoglutathione）在T240显著积累。羟基化脂肪酸、溶血磷脂和氧化固醇类等Level 3特征与脂质氧化和重塑一致。

4.4.2 非靶向脂质组学

脂质组学注释了113个MSI Level 2脂质种类，主要类别为鞘脂（1026个特征）、甘油酯（555）、脂肪酸酰基（551）、甘油磷脂（500）、固醇脂（79）和异戊二烯脂（54）。类别水平分析显示，脂肪酸酰基中位log?FC从T60的0.21增至T240的0.43，甘油酯从0.31增至0.46，鞘脂保持在0.20–0.32，异戊二烯脂从0.91大幅增至T240的2.02，固醇脂从0.01增至0.45；甘油磷脂在T60为?0.05，T120为0.08，T180和T240分别为?0.07和?0.10。特征水平分析显示，T240和T60分别有69和59个阶段特异性VIP脂质。鞘磷脂（如SM 58:7;3O、SM 12:0;2O/16:0）在T240显著增加，脂肪酸酰基和甘油酯的增加与甘油三酯和磷脂水解一致，甘油磷脂的减少与其高PUFA含量和氧化敏感性相关。

4.4.3 代谢组学和脂质组学数据融合

DIABLO整合分析显示，第一潜在成分的代谢组学和脂质组学块间相关系数r=0.98，分类误差从0.0367降至0.0133（代谢组学）和从0.154降至0.097（脂质组学）。顶级判别变量包括蛋白水解相关肽类（天冬氨酰-色氨酸log?FC=11.55、天冬酰胺酰-γ-谷氨酸、N-γ-L-谷氨酰-L-缬氨酸）、N-乙酰-L-半胱氨酸（硫醇相关氧化还原通路）、以及脂质组学块中的N-酰基甘氨酸（NAGly 22:5、NAGly 22:4、NAGly 20:1，在T240显著增加）、肉碱（CAR 16:0、CAR 16:2）和鞘磷脂（SM 27:6;2O）。层次聚类热图和箭头图按成熟阶段分离样本并展示代谢组学与脂质组学投影间的关系。

4.5 Pancetta Piacentina PDO成熟过程中的挥发性物质和感官特征

感官分析显示，T60样本具有较高鲜肉香气和咀嚼性，延长成熟增加融化性和黄油香气，同时降低鲜肉香气。哈败香气在后期成熟阶段更明显但保持适中。T240出现轻微苦味和涩味增加，可能与低分子量肽类（如天冬氨酰-色氨酸、组氨酰-色氨酸）相关。挥发性物质谱鉴定59种化合物，主要为醇类、醛类、酯类、烃类和萜烯类。HCA将T60与T120–T240分开，表明早期与中后期成熟阶段的整体挥发性指纹不同。2-甲基丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯是后期成熟组中最强判别化合物，与亮氨酸和异亮氨酸分解代谢及酯化相关。烃类显示显著时间变化（p=0.0223），而醇类、醛类、酯类和萜烯类无显著时间变化。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，成熟过程中PUFA相对比例的降低与次级脂质氧化产物（醛类、醇类、酮类）的形成相关，这些化合物贡献干腌肉制品的特征香气。过氧化值和TBARS的不同时间模式反映了初级和次级氧化产物积累的不同步性，可能与次级氧化产物与蛋白质、肽和氨基酸的相互作用有关。谷胱甘肽系统的显著改变表明内源性抗氧化能力在成熟早期即被大量消耗。代谢组学和脂质组学的整合分析揭示了蛋白质水解、脂质重塑和氧化之间的协调变化。N-γ-L-谷氨酰-L-缬氨酸可能贡献kokumi味道（阈值550 μmol/kg）。挥发性物质谱和感官分析作为互补证据，支持脂质氧化和蛋白质水解对风味发展的贡献。研究结论指出，Pancetta Piacentina PDO的成熟是脂质相关氧化、蛋白质水解和广泛代谢重塑相互作用的结果，而非单一分子特征的变化。多平台分析策略为研究传统干腌肉制品成熟过程中的生化和感官变化提供了综合框架。所识别的分子特征可作为技术成熟度、真实性或质量的潜在候选指标，但需在独立样本和不同生产条件下验证其可重复性和特异性。未来研究应评估这些分子特征在不同成熟条件、生产批次和PDO产品中的可重复性和特异性。