细胞色素 c 封装金属有机框架中限域触发的构象弛豫与电子转移协同作用用于稳健去除酚类和染料污染物

《International Journal of Biological Macromolecules》：Confinement-triggered conformational relaxation and electron transfer synergy in cytochrome c-encapsulated metal organic framework for robust removal of phenolic and dye pollutants

　　# 摘要传统废水处理通常依赖资源密集型过程。尽管酶处理提供了一种绿色高效的替代方案，但游离酶的固有不稳定性和固定化后活性降低的问题阻碍了酶在可持续工业操作中的实际部署。针对这一挑战，我们报道了一种简便的策略，用于在Cu-四甲酸根金属有机框架（Cyt c@Cu-MOF）中原位封装细胞色素c（Cyt c）。与常规载体不同，Cu-MOF基体诱导了一种双重调节机制，涉及Cyt c的限域触发的构象松弛以及与Cu节点的电子转移协同效应。这种双重调节使催化效率（*k*cat/*K*m）相比游离Cyt c提高了3倍，在去除不同酚类和染料方面分别实现了1.6至14倍和3至16倍的改善。机理研究证实，限域微环境优化了底物对酶活性位点的可及性，并通过可逆的Cu2?/Cu?氧化还原循环加速了自由基的产生。值得注意的是，Cyt c@Cu-MOF在极端环境（包括高温和有机溶剂）下表现出出色的稳定性。在连续流反应器中，它还表现出卓越的操作稳定性，在112小时的连续运行中保持超过95%的降解效率，处理容量比间歇模式高出2.5倍。本工作不仅为高效酶固定化提供了一种实用方法，还阐明了主客体工程在增强酶活性中的关键作用，为开发适用于可持续工业应用的稳健生物催化剂提供了有前景的范例。# 引言工业废水中酚类化合物和有机染料的广泛污染已成为日益严重的环境问题[1]、[2]、[3]。这些污染物具有高毒性、难降解性和潜在致癌性，对生态完整性和公共健康构成严重威胁。然而，常规修复技术不足以应对这些挑战。物理吸附作为一种权宜之计，只能将污染物截留而无法解毒；化学氧化策略虽然在降解方面有效，但常常受到高昂成本、低选择性和产生二次有毒副产物风险的制约[4]。在此背景下，生物降解已成为一种可持续且高效的替代方案[5]、[6]。具有氧化还原酶活性的生物催化剂通过利用其固有的环境相容性和高效性来激活氧化剂，产生活性氧物种以去除污染物，从而解决了这一问题[7]、[8]。其中，Cyt c是一种含卟啉的蛋白质，具有出色的过氧化物酶样活性，能够在过氧化氢存在下有效氧化多种芳香族化合物[9]、[10]。然而，游离酶的脆弱性严重阻碍了其实际使用，而固定化酶往往由于传质阻力和载体抑制而活性低下[11]、[12]、[13]。因此，设计能够同时提高稳定性和保持甚至增强催化性能的平台仍然是核心挑战。金属有机框架（MOFs）凭借其超高比表面积、可调控的孔道结构和良好的生物相容性，已成为有前景的酶载体[14]、[15]。将酶限域在MOF腔内可以将其与恶劣的外部环境隔离，从而显著增强操作稳定性[16]、[17]。此外，将MOFs与酶相结合可以利用两者的互补优势，创造协同生物杂化体，扩展催化功能性和稳健性[18]、[19]。该领域的最新进展表明，晶态MOF基体可以保护客体生物分子免受变性，促进共生强化效应，相互增强生物杂化体的结构完整性和生物功能[20]。此外，特定酶-MOF生物杂化体已被证明可作为自调节离子泵，通过释放的激活剂与酶之间的近程驱动协同作用来同步提升催化性能和耐久性[21]。这些开创性观察强调了理性主客体工程在调节协同相互作用以实现优异生物催化性能中的关键作用。在探索用于酶固定化的各种MOF中，沸石咪唑酯框架（ZIFs），尤其是ZIF-8和ZIF-L，已被最广泛地研究，而其他类型的MOF仍相对缺乏探索。此外，酶-MOF生物杂化体提供了一条从被动固定化向主动性能调控的途径。然而，给定MOF平台的催化结果受其配位环境、孔道结构、表面化学和主客体相互作用的控制。因此，从根本上理解宿主结构如何决定酶性能是一个关键前提。针对这一需求，近期研究已将注意力转向一种基于四甲酸的配体，这是一种独特的四元芳香配体，以其强配位亲和力和在水介质中的反应性而著称[22]、[23]。该配体在水中与铜离子快速组装形成Cu-MOF，从而实现酶的原位封装。与通常施加过度刚性从而限制生物大分子催化位点可及性的常规固定化系统相比，Cu-MOF提供了一种能够主动调节酶构象的限域微环境。然而，当前研究主要优先考虑MOFs的物理保护而非酶微环境的调控。鉴于铜节点的氧化还原活性特征和四甲酸根配体的特异性配位化学，Cu-四甲酸根平台提供了一个超越被动封装的契机[21]。选择Cyt c作为模型酶，是因为其催化活性对构象松弛敏感，构象松弛可暴露卟啉中心并激活其固有的过氧化物酶样活性[24]，且其体积小且无糖基化，有利于封装并简化主客体相互作用。因此，我们假设Cu-MOF晶格的刚性限域可以主动调节Cyt c的构象，而邻近的铜节点可能促进与卟啉铁中心的电子转移以加速底物活化。然而，尚完全未知的是这种协同效应能否在此四甲酸根基MOF系统中有效实现，以及空间限域如何控制构象调节与催化增强之间的关键联系。在本研究中，我们报道了一种简便的水相共沉淀策略，用于原位制备Cyt c@Cu-MOF生物杂化体，旨在解决酶-MOF系统中的稳定性-活性权衡问题。作为对照，我们采用ZIF-8和ZIF-L来提供与Cu-MOF的结构和组成对比。酶动力学分析显示，Cyt c@Cu-MOF具有增强的底物亲和力，其催化效率（*k*cat/*K*m）比游离Cyt c高3倍。去除实验表明，Cyt c@Cu-MOF在酚类和染料去除方面表现出优于游离Cyt c的催化性能。与通常以提高酶稳定性为代价牺牲固有活性的常规固定化方法不同，本工作展示了一种酶-框架协同催化机制。机理研究表明，活性增强源于微妙的酶构象调节以及Cu-MOF与Cyt c卟啉中心之间的协同电子转移（图1）。限域微环境诱导Cyt c构象松弛以暴露卟啉活性位点，并与Cu节点建立电子协同以促进自由基产生。通过操纵Cyt c与Cu-MOF之间的主客体相互作用，不仅增强了酶活性，还赋予了其抵抗热应力、有机溶剂和长期操作的卓越稳健性。在填充床连续流反应器中，Cyt c@Cu-MOF在112小时内保持超过95%的去除效率，处理容量比间歇模式高出2.5倍。总体而言，这种限域工程策略将生物催化与化学催化整合到一个稳健的生物杂化体平台中，证明了Cu-MOF宿主可以同时诱导构象松弛、增强界面电子转移，并在与实用生物催化相关的连续流条件下显著改善操作耐久性。# 各节摘要## Cu-MOF、Cyt c@Cu-MOF和Cyt c&Cu-MOF的制备Cu-MOF的合成方法如下：在室温下磁力搅拌条件下，将四甲酸根钠水溶液（0.095 M，1 mL，pH 6.0）与乙酸铜二水合物（Cu(CH?COO)?·H?O）（0.1 M，1 mL）水溶液混合。搅拌20分钟后，通过离心（12,000 rpm，5分钟）获得产物，用去离子水洗涤三次，然后冷冻干燥。对于Cyt c@Cu-MOF生物杂化体的制备，将2.0 mg Cyt c预先溶解在四甲酸根钠溶液中。## Cyt c@Cu-MOF的合成与表征温和的合成条件对于在酶-MOF生物杂化体制备过程中保持酶的原生结构和生物功能性至关重要[25]。为应对这一要求，我们利用了四甲酸与铜离子的快速自组装能力，使得在水相温和条件下即可形成晶态框架，而不损害酶的完整性。在典型操作中，将Cyt c引入含有铜离子的前驱体溶液中。## 结论总之，本研究通过快速一锅法水相共沉淀策略成功构建了高性能的Cyt c@Cu-MOF生物杂化体，实现了超过90%的高封装效率。与传统固定化方法（通常以提高酶稳定性为代价牺牲固有活性）不同，本工作建立了由Cu-MOF宿主双重功能启发的酶-框架协同催化机制。限域微环境诱导……## CRediT作者贡献声明**Jiaxi Li：** 方法论、调查、形式分析、数据整理。**Ziping Li：** 调查、形式分析、数据整理。**Rubing Bai：** 调查、数据整理。**Feilong Wang：** 调查、数据整理。**Hua Cao：** 方法论、概念化。**Huan Xia：** 写作——审阅与编辑、监督、资源、资金获取、概念化。## 写作过程中生成式AI及AI辅助技术声明作者使用NanoBanana生成示意图，使用Origin进行图表绘制和统计分析。AI辅助技术也用于优化语言和增强文本清晰度。## 利益冲突声明作者声明在本工作中不存在利益冲突。## 致谢衷心感谢中国国家自然科学基金（编号：22208223）的资金支持。作者：Jiaxi Li、Ziping Li、Rubing Bai、Feilong Wang、Hua Cao、Huan Xia