《International Journal of Biological Macromolecules》：Bioactive keratin–pectin methacrylate multifilament nerve conduits for functional regeneration across segmental nerve defects
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摘要严重外周神经损伤的修复需要具有生物活性的导管，在提供结构引导的同时支持细胞再生。在本研究中，我们设计了一种仿生水凝胶导管，由甲氧基丙烯酸化果胶（PecMA）与人类头发衍生的角蛋白偶联而成，将束状仿生结构与生化信号整合在一起。角蛋白采用基于尿素的还原策略提取，并通过硫醇-烯
摘要
严重外周神经损伤的修复需要具有生物活性的导管，在提供结构引导的同时支持细胞再生。在本研究中，我们设计了一种仿生水凝胶导管，由甲氧基丙烯酸化果胶（PecMA）与人类头发衍生的角蛋白偶联而成，将束状仿生结构与生化信号整合在一起。角蛋白采用基于尿素的还原策略提取，并通过硫醇-烯化学偶联到PecMA上，制得一种双重交联生物墨水。通过自主开发的多丝挤出平台，实现了取向束状导管的制备。体外研究表明，载细胞构建体在引入角蛋白后表现出均匀的细胞分布、高细胞活力和增强的神经突起延伸。PC12细胞神经突起长度从第1天的6.28 ± 0.49 μm增加到第14天的64.77 ± 4.85 μm，qRT-PCR显示与仅含PecMA组相比，神经元相关基因（PRPH、TUBB3、NEFH）和施万细胞/髓鞘化相关基因（PMP22、MBP、MPZ）的表达水平升高。体内实验中，无细胞角蛋白-PecMA导管在大鼠坐骨神经缺损模型中得到评估，结果显示良好的生物相容性、取向的轴突再生和减少的纤维组织浸润。角蛋白-PecMA组的SFI评分逐步改善，足滑移百分比从第2周的32.5 ± 3.2%降至第8周的15.0 ± 2.2%。在第8周，SFI评分（-60.95 ± 2.68 对比 -57.73 ± 3.99）、神经纤维直径（2.12 ± 0.12 对比 2.11 ± 0.25 μm）和肌肉与胶原比值（3.21 ± 0.06 对比 2.95 ± 0.25）在角蛋白-PecMA组与自体移植组之间差异不大。总体而言，这些发现支持角蛋白-PecMA多丝导管作为外周神经再生的一种有前景的仿生策略。
引言
外周神经损伤（PNI）通常由外伤、手术并发症或慢性疾病引起，正日益成为一项严峻的公共健康挑战。这类损伤往往导致严重的运动和感觉功能缺失，极大地影响患者的生活质量。[1] 尽管自体神经移植术仍是目前的临床金标准，但由于移植物与宿主神经组织之间存在束状结构不匹配的问题，其效果往往不理想。[2] 全球外周神经损伤管理市场预计到2029年将达到71.2亿美元，复合年增长率（CAGR）为12.5%，反映了改善治疗方案的迫切需求。[3] 为应对节段性神经缺损，生物材料研究日益聚焦于开发兼具原生神经结构特征和功能的组织工程构建体。[4], [5]
水凝胶由于其可调的力学性能、柔韧性与软组织（如神经和血管）的相似性，已成为极具前景的候选材料。[6], [7], [8] 特别是源自天然多糖和蛋白质的水凝胶，具有固有的生物相容性和生物活性，适用于神经导管（NGC）的制备。[9] 这些材料既可通过定制化结构进行结构仿生[10], [11], [12]，也可通过细胞相互作用基序实现生物化学功能[13], [14], [15]。多数方法侧重于其中某一方面的优化，而理想的神经再生需要两者的协同整合，以支持迁移、增殖和分化等关键细胞过程。
我们小组开发了一种无模板多丝神经导管制备策略，利用定制挤出系统实现了精确的束状取向，模拟天然神经解剖结构。[16] 果胶是一种源自植物细胞壁的阴离子多糖，属于一般公认安全（GRAS）聚合物，以其生物相容性而广为人知。果胶的一个关键优势是其在二价阳离子（如钙离子）存在下能够快速发生离子凝胶化，同时其丰富的功能基团为化学修饰提供了多种选择。特别是，对果胶主链上的羟基进行甲氧基丙烯酸化，同时保留羧基用于离子交联，可赋予双重交联能力，既支持离子相互作用，又通过光交联实现共价稳定。为进一步增强再生潜力，水凝胶系统常与生物活性蛋白（如细胞外基质（ECM）蛋白[17]、角蛋白[18], [19]、酪蛋白[20], [21]和合成肽段[22]）进行功能化。这些生物分子引入细胞相互作用基序，促进黏附、增殖和分化。角蛋白是一种源自人类毛发或羊毛的纤维状结构蛋白，在外伤修复领域尤其引人注目。它含有RGD、LDV和EDS等生物活性肽序列，可介导整合素依赖性黏附。[23], [24] 其高度的序列保守性、固有的生物相容性和可调的化学性质使其成为神经再生的有力候选材料。[25] 角蛋白的提取可通过氧化或还原过程实现，其中还原过程使用还原剂（包括β-巯基乙醇），可制得保留天然结构并引入游离巯基的角蛋白水解物。[26] 此前的研究表明，角蛋白基水凝胶具有神经诱导效应，在体外促进施万细胞增殖、迁移以及神经元和胶质细胞标志物的表达。[27] 在临床前动物模型中，角蛋白填充导管提高了轴突密度并支持了长期功能恢复。[18], [19]
尽管束状仿生神经导管和角蛋白基生物材料已分别在外周神经修复中显示出潜力，但结构引导与角蛋白衍生的生化信号在同一导管系统中的联合效应仍缺乏充分的探索。因此，我们开发了一种角蛋白偶联的PecMA多丝导管，并假设取向的束状仿生结构与生物活性角蛋白信号的结合将协同增强轴突再生，并减少纤维组织浸润，优于单独的多丝结构。
本研究通过将角蛋白与PecMA整合，实现结构保真与生化功能的协同，提出了一种创新策略。角蛋白中的游离巯基通过硫醇-烯化学实现共价偶联，便于稳定整合到光交联水凝胶网络（如PecMA）中。所制备的双重交联生物活性多丝神经导管经过细胞相容性和细胞-材料相互作用评估。采用PC12神经元细胞或RSC96施万细胞制备了活性多丝神经导管，并对其细胞骨架组织和谱系特异性标志物进行了检测。通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察了肌动蛋白（细胞骨架）、NF200（神经元）和S100β（施万细胞）。NF200是一种IV型中间丝蛋白，对维持轴突稳定性和直径至关重要，通过磷酸化介导的交叉桥接影响传导速度。[28] S100β是一种钙结合蛋白，在髓鞘合成和维持中发挥关键作用，其表达与髓鞘厚度和轴突支持相关。[29] 为补充这些观察，对神经元标志物（NEFH、PRPH、TUB）和施万细胞标志物（PMP22、MBP、MPZ）的基因表达谱进行了分析，以追踪早期和晚期分化阶段。
最后，在无细胞导管的Wistar大鼠坐骨神经损伤模型中评估了再生效果，其中10 mm的坐骨神经节段性缺损分别使用PecMA或角蛋白-PecMA多丝神经导管修复。通过行为学测试进行纵向功能恢复评估，包括步态分析和倾斜梁测试。通过组织学和组织形态学分析（甲苯胺蓝染色、免疫组织化学、Masson三色染色和苏木精-伊红染色）定量评估神经直径、纤维取向和细胞外基质组织等参数。总体而言，这些研究阐明了束状取向与角蛋白偶联在促进外周神经修复中的联合作用。
各部分内容摘要
材料
橙皮来源的果胶（P9135）、甲基丙烯酸酐、氢氧化钠（NaOH）、氯化钙（CaCl?）、三乙醇胺、N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）、尿素、Tris碱、Triton-X-100、磷钨酸、甲苯胺蓝以及针对NF200和S100的一抗均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。硫脲购自SRL Chemicals（印度），β-巯基乙醇和牛血清白蛋白（BSA）购自Himedia Laboratories（印度孟买）。
提取角蛋白的分析验证
通过基于尿素的还原法从人类毛发中提取角蛋白，获得适用于生物材料应用的角蛋白水解物。通过扫描电子显微镜（SEM）监测了提取过程中不同阶段——脱脂、还原和透析后——的形态变化。观察到原生毛发结构的逐步破坏以及结构蛋白的最终溶解（图1a）。最终提取物的蛋白质浓度通过
讨论
长段外周神经损伤仍是一项严峻的临床挑战，因其对感觉和运动功能的影响深远。尽管自体移植术仍被视为金标准，但其临床应用受到供体部位并发症、组织供应受限和束状结构不匹配风险的制约，均影响功能恢复效果。市售神经导管虽可为短段修复提供部分替代方案，但缺乏束状
结论
本研究展示了角蛋白-PecMA生物墨水的成功开发及其在多丝神经导管制备中的应用，该导管整合了束状仿生结构与角蛋白衍生的生物活性信号。经验证的PecMA多丝平台具有适用于神经修复的结构和力学性能，而角蛋白功能化进一步增强了其生物学表现。角蛋白-PecMA多丝导管在体外保持了稳定性，且
CRediT作者贡献声明
Preethy Amruthavarshini Ramesh：论文撰写-初稿、验证、方法学、调查、形式分析、数据整理。Madhumithra Thangadurai：调查。Swaminathan Sethuraman：论文撰写-审阅与编辑。Anuradha Subramanian：论文撰写-审阅与编辑、监督、资源、概念化。
伦理声明
实验动物购自SASTRA名誉大学中央动物设施（CAF），所有手术操作均按照经SASTRA名誉大学机构动物伦理委员会（IAEC）批准的指南进行（批准编号：706/SASTRA/IAEC/RPP）。
致谢
作者感谢FIST（SR/FST/LSI-327/2007和SR/FST/LSI-622/2014）、纳米使命委员会（SR/NM/TP-83/2016(G)）、印度科学与技术部、生物技术研究部（BT/PR26760/NNT/28/1433/2017）、印度政府以及SASTRA大学T. R. Rajagopalan教授研发办公室提供的资金支持。作者感谢SASTRA名誉大学及SASTRA TBI生物启发领导者与企业家协会（ABLEST）
Preethy Amruthavarshini Ramesh|Madhumithra Thangadurai|Swaminathan Sethuraman|Anuradha Subramanian
