《International Journal of Biological Macromolecules》：A rhamnogalacturonan I-enriched pectic polysaccharide from alfalfa and its protective effects against oxidative stress in
Caenorhabditis elegans
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摘要苜蓿多糖（APs）因其报道的抗氧化活性而受到广泛关注；然而，化学结构明确的APs组分仍然缺乏充分表征，其生物活性也很少在全生物体氧化应激模型中得到评估。本研究采用超声-酶解法从苜蓿中分离出一种主要多糖组分（APs-4），并通过顺序离子交换和凝胶过滤色谱进行纯化。APs-4
摘要
苜蓿多糖（APs）因其报道的抗氧化活性而受到广泛关注；然而，化学结构明确的APs组分仍然缺乏充分表征，其生物活性也很少在全生物体氧化应激模型中得到评估。本研究采用超声-酶解法从苜蓿中分离出一种主要多糖组分（APs-4），并通过顺序离子交换和凝胶过滤色谱进行纯化。APs-4被表征为一种低甲氧基果胶多糖，其重量平均分子量（Mw）为71.97 kDa，分散度（?）为1.02。单糖组成、甲基化分析和核磁共振波谱支持了一种富含鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I（RG-I）的结构模型，其中RG-I相关含量和均半乳糖醛酸聚糖（HG）相关含量估计分别为80.2%和8.0%。其推测的主链主要由交替的→4)-α-半乳糖吡喃糖醛酸（GalpA)-(1→和→2,4)-α-鼠李糖吡喃糖基（Rhap)-(1→残基组成，并带有富含阿拉伯聚糖和半乳糖聚糖的侧链。在百草枯诱导的秀丽隐杆线虫（C. elegans）氧化应激模型中，0.5 mg/mL的APs-4处理将平均存活时间从4.57 h延长至8.87 h。这种保护作用伴随超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性增加，谷胱甘肽（GSH）水平升高，丙二醛（MDA）水平降低，以及包括daf-16、skn-1、sir-2.1和sod异构体在内的应激应答基因转录上调。这些结果表明，APs-4对百草枯诱导的C. elegans氧化应激具有保护作用，并提供了将处理与抗氧化指标变化和应激相关基因转录变化相关联的关联证据。现有数据尚未确立因果通路参与或直接构效关系，但为未来的通路特异性遗传研究和比较结构分析提供了基础。
引言
苜蓿（Medicago sativa L.）是一种重要的牧草豆科植物，含有结构多样的多糖，具有有前景的生物活性[1]。苜蓿多糖（APs）因其报道的免疫调节、抗炎和抗氧化特性而受到越来越多的关注[2]，[3]，[4]，[5]。然而，大多数先前的研究集中于粗提物或表征不充分的多糖制剂，其成分异质性阻碍了确定导致观察到的生物效应的特定组分，并限制了研究之间的有意义的比较。因此，分离和全面表征化学结构明确的APs组分对于可靠地评估和解释其生物活性至关重要。
提取条件可以显著影响植物多糖的产量、组成、分子特性和理化性质。常规提取方法，包括热水提取、微波辅助、超声辅助和酶辅助技术，在提取效率、多糖完整性保存和可扩展性方面各有其优势和局限性[6]。热水提取简单且广泛使用，但通常提取效率相对较低，而微波和超声辅助方法可以增强多糖释放，但在施加过多热能或机械能时可能会改变分子特性[7]，[8]，[9]。酶辅助提取可以通过在相对温和的条件下部分降解植物细胞壁成分来促进多糖释放。因此，本研究采用了联合超声-酶解程序。提取条件是根据初步实验室评估和先前报道的超声和酶辅助提取程序[10]，[11]选择的，然后固定并应用于三个独立提取批次，以评估提取和纯化过程的操作重复性。
果胶多糖是苜蓿的主要多糖成分，主要由均半乳糖醛酸聚糖（HG）和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I（RG-I）结构域组成。HG是α-1,4-连接的半乳糖醛酸（GalA）残基的线性聚合物，可能被甲基酯化或乙酰化，而RG-I由重复的[→2)-α-L-鼠李糖吡喃糖基（Rhap)-(1 → 4)-α-D-半乳糖吡喃糖醛酸（GalpA)-(1→]主链组成，其中鼠李糖（Rha）残基可以在C-4位被阿拉伯聚糖、半乳糖聚糖或阿拉伯半乳糖聚糖等中性侧链取代[12]。分支模式、分子量和甲酯化度（DM）等结构特征可以显著影响果胶多糖的理化性质和生物相互作用[13]。Chen等人此前从苜蓿茎中分离出一种RG-I型果胶多糖；然而，其异常高的分子量（2380 kDa），远高于大多数具有生物活性的果胶多糖报道的分子量，使其溶液行为和潜在生物性能受到质疑[14]。此外，包括DM、三螺旋构象、粒径和Zeta电位在内的重要结构参数未被表征[15]。这些局限性凸显了需要对化学结构明确的苜蓿果胶多糖进行进一步研究，并进行全面的结构表征，以促进未来对其在生物系统中构效关系的研究[14]。
氧化应激源于活性氧（ROS）产生与内源性抗氧化防御之间的失衡，与衰老和多种年龄相关疾病的发生发展密切相关[16]，[17]。植物来源的多糖因其生物相容性以及通过直接清除ROS、增强内源性抗氧化防御或调节保守的应激应答通路（包括胰岛素/胰岛素样生长因子-1（IIS）通路和雷帕霉素靶标（TOR）通路）来缓解氧化应激的能力，作为天然抗氧化剂受到了广泛关注[18]，[19]。然而，APs的生物活性主要使用化学抗氧化试验、培养细胞或粗提物和表征不完全的多糖制剂进行评估。因此，纯化的、化学结构明确的苜蓿多糖组分对全生物体氧化应激抵抗力的影响，以及相关的生化和转录应答，在很大程度上仍未被探索。
Caenorhabditis elegans（C. elegans）是一种用于研究氧化应激应答的成熟模式生物，因为其生命周期短、遗传可操作性强，且具有进化保守的应激应答通路，包括IIS通路[20]。在本研究中，百草枯通过产生ROS来诱导氧化应激，为同时评估生物体存活率、抗氧化指标和应激应答基因转录提供了成熟的实验模型[21]。
为解决这些知识空白，苜蓿多糖在确定的超声-酶解条件下被提取，并通过顺序离子交换和凝胶过滤色谱纯化。主要纯化组分，标记为APs-4，通过单糖组成分析、分子量测定、傅里叶变换红外（FT-IR）光谱、甲基化分析、核磁共振（NMR）光谱和互补的理化分析进行了全面表征。随后在百草枯应激的C. elegans中，通过测量存活率、抗氧化酶活性、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平以及选定应激应答基因的转录，评估了APs-4的保护作用。我们假设纯化的APs-4将改善对百草枯诱导的氧化应激的抵抗力，并且这种保护作用将伴随内源性抗氧化防御和应激应答基因转录的变化。通过将结构表征与全生物体生物评估相结合，本研究为未来结构不同的APs的比较研究和通路特异性遗传分析提供了基础。
各节摘要
材料与化学品
从中国农业科学院尚庄试验站收获无可见病害症状的新鲜苜蓿。样品经冲洗，在45 °C下干燥至恒重，研磨至通过0.425 mm筛网。除另有说明外，所有化学品均为分析纯，实验全程使用去离子水。纤维素酶（R-10，来自里氏木霉，≥10,000 U/g）购自Yakult投资有限公司（中国上海）。
粗多糖提取的重复性
在相同的操作条件下，超声-酶解提取程序独立进行了三个批次。三个批次的粗AP得率分别为6.09%、5.46%和5.85%，基于起始苜蓿材料的干重，平均得率为5.80 ± 0.32%（相对标准偏差（RSD）= 5.52%）（补充数据表2）。批次间变化小表明所定义的提取程序在……条件下的操作重复性良好
结论
本研究采用在确定条件下的超声-酶解提取方法，从苜蓿中可重复地分离出APs-4作为主要的酸性多糖组分。结构分析支持APs-4为一种低甲氧基、富含RG-I的果胶多糖（Mw = 71.97 kDa，? = 1.02，DM = 12.25%），其中RG-I相关含量和HG相关含量估计分别为80.2%和8.0%。其推测的主链主要由交替的→4)-α-GalpA-(1→和→2,4)-α-Rhap-(1→残基组成，
CRediT作者贡献声明
黄凌特：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，方法学，调查研究，正式分析。王合钦：方法学，调查研究，正式分析。刘远：可视化，方法学。王绍鹏：方法学，调查研究。滕守真：软件，调查研究。张秀清：方法学。蒋远学：调查研究。Revocatus Bahitwa：写作 – 审阅与编辑。赵晶：写作 – 审阅与编辑，监督。王赞：写作 – 审阅与编辑，监督，
利益冲突声明
作者声明他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能影响本文所报告的工作。
致谢
本研究由国家林业和草原种质资源中心（2005DKA21003）资助。
黄凌特|王合钦|刘远|王绍鹏|滕守真|张秀清|蒋远学|Revocatus Bahitwa|赵晶|王赞
