《Metabolic Engineering》：A kinetically constrained dynamic flux balance analysis model predicts diverse CHO-cell culture process modes and conditions
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•利用实验测定的补料分批细胞培养数据，构建了一个包含68个反应和42个代谢物的紧凑反应网络，其中包括19种典型氨基酸。该反应网络与表型驱动的动力学表达相结合，生成了动态通量平衡分析（dFBA）模型。•该dFBA模型能够预测生物工艺性能指标，如有效细胞浓度、单克隆抗体（mAb）
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利用实验测定的补料分批细胞培养数据，构建了一个包含68个反应和42个代谢物的紧凑反应网络，其中包括19种典型氨基酸。该反应网络与表型驱动的动力学表达相结合，生成了动态通量平衡分析（dFBA）模型。
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该dFBA模型能够预测生物工艺性能指标，如有效细胞浓度、单克隆抗体（mAb）、氨基酸、葡萄糖、乳酸和氨的浓度。
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该模型的开发旨在在各种工艺条件下进行这些预测，包括生物反应器pH值、培养基浓度、补料添加方案和初始细胞密度。
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预测并实验验证了高接种细胞密度和增加补料培养基添加的影响，结果表明mAb滴度与传统补料分批工艺相似，但培养时间大幅缩短。
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利用传统补料分批工艺数据训练的dFBA模型，成功预测了灌流生物反应器培养性能，并经过实验验证。
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还预测了在AMBIC参考培养基下细胞培养工艺的性能。模型复现了现有的实验测量轨迹，并为培养基改进提供了潜在机会的见解。
引言
治疗性糖蛋白因其复杂的结构（包括翻译后修饰）已成为多种疾病的有效治疗手段。在过去几十年中，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞已成为生产单克隆抗体（mAbs）的主要平台（Dhara等，2018）。开发在CHO细胞中生产这些治疗药物的工艺涉及细胞系开发、培养基优化、补料方案优化、生物反应器参数优化和放大（Bielser等，2018）。这些过程通常相互关联，需要进行大量实验来确定最佳操作条件，因为大量关键工艺参数（CPPs）（pH值、温度、培养基组成、补料方案和接种细胞密度）都可能影响生物反应器性能。例如，生物反应器温度或pH值的变化会导致营养摄取率或抑制物生成率的变化（Ahn等，2008；Yoon等，2005）。因此，需要昂贵且费力的实验来筛选许多不同的培养基配方、补料方案和生物反应器条件，以最大化mAb滴度。治疗性糖蛋白的生产正从传统补料分批平台转向强化补料分批培养和灌流生物反应器。强化补料分批生物反应器以高细胞密度接种（得益于N-1灌流生物反应器的辅助），通过跳过传统补料分批培养的初始生长阶段，以大幅缩短的培养时间达到与补料分批工艺相似的抗体滴度。较短的运行时间是可取的，因为它们可以最大限度地利用大型生产设施（Chen等，2018）。灌流生物反应器利用细胞截留装置和连续培养基交换来实现高细胞密度（超过1亿个细胞/mL），并且可以运行更长的时间，同时持续生产mAb。在高细胞比生产率下，灌流生物反应器可以改善工艺经济性，但也增加了工艺复杂性（Yang等，2019）。
可靠的数学模型可以通过指导有意义的实验来达到最佳工艺条件，从而帮助简化和优化制造及基于工艺开发的研发任务（Chakrabarty等，2013；Sommeregger等，2017）。哺乳动物细胞培养的建模非常复杂，因为工艺性能可能受许多代谢物（氨基酸、糖类、维生素和抑制剂）浓度以及工艺条件（pH值、温度、溶解氧）的影响。进一步的复杂性在于，在补料分批工艺中，这些代谢物的浓度会随培养时间的变化而变化。动力学模型提供了一种简单的经验框架，通过半经验构建的常微分方程将营养浓度与其摄取率和细胞生长率联系起来。这些模型可以求解以解析营养物质的时间曲线，并已被应用于确定补料方案（Kiparissides等，2015）。化学计量模型是非参数化的，依赖于代谢物的摄取和分泌通量来预测细胞内通量分布。结合动力学和化学计量模型可以对哺乳动物细胞代谢进行动态培养曲线的模拟，同时保持机理保真度（Reddy等，2023）。耦合动力学和化学计量模型提供了一个更可靠的系统，可以在原始模型训练设计空间之外进行预测。
我们小组已发表的实验数据表明，生物反应器pH值通过影响葡萄糖摄取率、乳酸产生率、氨产生率、氨基酸摄取率、细胞生长率和细胞比mAb生产率，显著影响CHO细胞代谢（Reddy等，2025）。然而，文献中很少有模型（Ghodba等，2025；Hogiri等，2018）在建模CHO细胞代谢时显式地包含生物反应器pH值的影响。
在本工作中，我们开发了一个动态通量平衡分析模型，能够预测葡萄糖、乳酸、氨、必需和非必需氨基酸、细胞密度和mAb的时间浓度曲线，这些预测基于生物反应器pH值、基础培养基组成、补料培养基组成、培养基添加策略和接种细胞密度。这一目标是通过构建一个精简反应网络并通过通量平衡分析（FBA）求解来实现的，同时开发了动力学方程来模拟糖酵解、19种氨基酸的代谢和细胞生长率。该模型使用在pH设定值为6.75、7.00和7.25的CHO VRC01细胞系产生的补料分批生物反应器数据进行训练（Reddy等，2025）。我们使用仅在补料分批数据上训练的dFBA模型，通过改变接种细胞密度、生物反应器pH值、补料培养基添加或工艺模式（灌流），来预测CHO细胞在强化补料分批和灌流培养中的性能。随后的强化补料分批和灌流实验验证了模型预测，展示了dFBA模型在不同工艺条件下预测培养轨迹的能力。该模型还通过预测与训练数据完全不同培养基组成下的细胞培养性能进行了进一步测试，即AMBIC参考培养基。使用文献中的实验数据验证了AMBIC参考培养基下工艺性能的预测，模型复现了现有的实验测量轨迹（Cordova等，2023）。
章节摘要
细胞系和培养基础
本研究使用了CHO-K1细胞系（克隆A11，来自美国国家卫生研究院疫苗研究中心），该细胞系稳定表达一种广谱中和抗HIV单克隆抗体（VRC01）。CHO细胞在125 mL锥形瓶中培养，培养体积为30 mL，用于传代和接种物制备。用于接种的锥形瓶以0.4百万个细胞/mL的密度接种，并在37°C下于设定为85%相对湿度、20% O2和5% CO2的孵育器中培养。HyClone ActiPro
模型构建
本工作的目标是利用数学建模与历史补料分批数据来预测强化补料分批生物反应器、灌流生物反应器以及不同培养基配方下的生物工艺性能。为实现该目标，必须满足以下建模标准。
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易控制的生物工艺CPPs的影响，如初始营养物浓度（基础培养基配方）、初始有效细胞密度、生物反应器pH值以及动态营养物浓度对
模型参数化和动力学参数估计
我们在pH设定值为6.75、7.00和7.25的条件下生成了一个高维度、多样化的补料分批生物反应器数据集（Reddy等，2025）。简要来说，我们观察到在不同pH设定值之间，比生长率、底物需求和代谢物及mAb产生率存在显著差异。此外，我们观察到关键代谢物如乳酸、氨和丙氨酸的代谢转变在时间和幅度上也存在显著差异。根据敏感性分析（图4），
结论
本工作解决了缺乏包含生物反应器pH值影响的详细CHO细胞代谢模型的问题。虽然文献中存在动态代谢通量分析模型（Nolan和Lee，2011），但它们不包含生物反应器pH值的影响，并且仅模拟了氨基酸代谢的一个有限子空间。在这里，我们开发了一个动态通量平衡分析模型，能够预测细胞密度、葡萄糖、乳酸、氨基酸、氨和mAb的浓度作为
CRediT作者贡献声明
Jason Souvaliotis：调查。Nikola Malinov：写作——审阅与编辑，写作——初稿，软件，方法学，调查，形式分析，数据管理，概念化。Eleftherios Terry Papoutsakis：写作——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取，数据管理，概念化。Marianthi Ierapetritou：写作——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取，概念化。
代码和数据可用性
模型代码、数据和相关文件可在作者收到请求后提供，但需符合机构知识产权要求。
利益冲突声明
作者声明，他们是特拉华大学提交的一项临时专利申请上的署名发明人，该专利部分涵盖了本手稿中描述的主题。作者声明没有其他可能影响本文所报告工作的经济利益或个人关系冲突。
致谢
本研究由美国食品药品监督管理局资助，资助编号为DHHS-FDA-R01FD006588、资助编号为U01FD007695A。本研究还得到了特拉华大学（Caviness集群）提供的计算资源支持。
Jayanth Venkatarama Reddy|Nikola Malinov|Jason Souvaliotis|Marianthi Ierapetritou|Eleftherios Terry Papoutsakis
