《Frontiers in Immunology》：MGST3 defines a mitochondrial-health-associated M2 macrophage state in atherosclerosis: integrative multi-omics, single-cell mediation, and functional validation
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背景：线粒体功能障碍日益被认为是动脉粥样硬化（AS）中巨噬细胞适应性不良极化的驱动因素，但决定疾病相关巨噬细胞状态的线粒体基因仍不明确。方法：研究人员整合了加权基因共表达网络分析（WGCNA）、机器学习、两样本孟德尔随机化（two-sample MR）、批量转
背景：线粒体功能障碍日益被认为是动脉粥样硬化（AS）中巨噬细胞适应性不良极化的驱动因素，但决定疾病相关巨噬细胞状态的线粒体基因仍不明确。方法：研究人员整合了加权基因共表达网络分析（WGCNA）、机器学习、两样本孟德尔随机化（two-sample MR）、批量转录组学、单细胞分析、疾病水平验证、单细胞中介分析及体外扰动，以识别AS中与巨噬细胞相关的线粒体调控因子。结果：WGCNA和机器学习一致优先筛选出8个候选基因；其中，微粒体谷胱甘肽S-转移酶3（MGST3）显示出最强的保护性遗传信号。两样本MR支持遗传预测的MGST3表达与冠状动脉疾病/冠心病风险之间的保护性关联（训练集OR=0.989，95%CI 0.978-0.999，P=0.042；测试集OR=0.977，95%CI 0.960-0.995，P=0.013）。人颈动脉斑块验证确认AS病变中MGST3在mRNA和蛋白水平均降低。值得注意的是，尽管整体斑块下调，单细胞和疾病水平分析显示AS中MGST3高表达的M2样巨噬细胞状态扩增，提示病变斑块内存在代偿性保护性巨噬细胞程序。MGST3高表达的M2样细胞呈现氧化磷酸化（OXPHOS）导向、抗氧化和较低炎症的转录状态，作为活跃的信号群体，并显示出更高的复合线粒体健康（MitoHealth）评分。单细胞中介分析进一步表明，MitoHealth在统计学上将较高的MGST3表达与较低的炎症活性、较低的M1样极化和较低的致动脉粥样硬化巨噬细胞编程联系起来。在M2极化的巨噬细胞中，MGST3敲低降低了M2相关及线粒体/抗氧化转录本，同时增加了促炎转录本，提供了转录水平的功能支持。PheWAS分析在预设阈值下未检测到显著的表型关联。结论：这些发现将MGST3定义为线粒体健康相关的M2样巨噬细胞状态的标志物，该状态在AS斑块中似乎扩增，尽管整体斑块MGST3表达降低。MGST3-MitoHealth轴可能代表一种与线粒体保存和较低促动脉粥样硬化激活相关的代偿性巨噬细胞程序，值得在AS中进行进一步的诊断和治疗研究。
**研究背景与问题**
动脉粥样硬化（AS）是一种慢性炎症性动脉壁疾病，即使有效控制传统危险因素，残余心血管风险仍持续存在，因此需要识别斑块内局部、细胞类型特异性的分子程序。巨噬细胞功能障碍是AS发病的核心，线粒体代谢与巨噬细胞极化密切相关：M1样促炎巨噬细胞依赖糖酵解，M2样修复型巨噬细胞依赖氧化磷酸化（OXPHOS）。线粒体质量控制失败可推动炎症激活。然而，哪些线粒体基因在AS斑块中将氧化还原代谢、脂质应激和巨噬细胞极化偶联起来尚不清楚。既往生物信息学研究多基于bulk组织相关性，无法明确候选基因是否作用于特定巨噬细胞状态，也缺乏遗传证据支持。为此，研究人员建立了整合多组学框架，从遗传、单细胞和功能层面系统筛选AS中巨噬细胞相关的线粒体调控因子。
**研究概括与意义**
研究人员整合了WGCNA、机器学习、两样本孟德尔随机化、批量转录组、单细胞分析、疾病水平验证、单细胞中介和体外扰动，发现MGST3是最一致的候选基因，其遗传预测表达与冠心病风险降低显著相关。在AS斑块中，尽管整体组织MGST3下调，但单细胞分析显示MGST3高表达的M2样巨噬细胞亚群扩增，该亚群呈现线粒体健康、抗氧化和低炎症特征。体外敲低实验支持MGST3维持M2样抗炎和线粒体功能。研究将MGST3-MitoHealth轴提名为AS中潜在代偿性保护性巨噬细胞程序，为诊断和治疗提供了新方向。
**主要关键技术方法**
研究人员利用GEO中4个发现数据集（GSE28829、GSE41571、GSE43292、GSE163154，共147例）整合成表达矩阵，依次采用WGCNA、LASSO和SVM-RFE筛选候选基因；利用eQTLGen和GTEx V8作为表达数量性状位点（eQTL）来源，结合CAD（ebi-a-GCST005194）和CHD（ieu-a-7）的GWAS汇总数据进行两样本孟德尔随机化；使用单细胞RNA-seq数据GSE159677（3例正常和3例AS颈动脉）进行细胞聚类、功能状态、通路/转录因子活性、虚拟敲低、细胞通讯和单细胞中介分析；用GSE111782（9例AS和9例对照颈动脉）验证共表达；并收集10例患者颈动脉斑块及配对非斑块组织进行RT-qPCR、免疫组化和Western blot；在THP-1来源M2巨噬细胞中实施MGST3敲低。主要技术还包括CIBERSORTx免疫浸润、ssGSEA、BisqueRNA反卷积、PROGENy、DoRothEA、scTenifoldKnk、CellChat等。
**研究结果**
**WGCNA识别AS相关共表达模块**：对整合矩阵中变异度最高的25%基因进行WGCNA，鉴定出与AS状态、破裂阶段、晚期病变和斑块内出血显著相关的pink模块，且模块成员度与基因显著性强相关，为后续筛选提供基础。
**机器学习和两样本MR鉴定关键线粒体基因**：pink模块与MitoCarta3.0取交集获得51个线粒体基因，经LASSO和SVM-RFE共同识别出8个基因（IMMP2L、BCL2A1、GATM、PPIF、PMAIP1、MRPL33、CPS1、MGST3）。两样本MR显示仅MGST3的遗传预测表达与CAD和CHD风险均显著负相关（训练集OR=0.989，P=0.042；验证集OR=0.977，P=0.013），提示其保护性遗传信号。
**对照与AS样本免疫微环境特征**：CIBERSORTx显示AS样本中M0巨噬细胞丰度升高，CD8 T细胞和静息树突状细胞浸润减少；候选基因与M0丰度呈分化关联，其中MGST3与M0丰度负相关。
**单细胞分析将MGST3定位至M2样巨噬细胞**：对GSE159677单细胞数据聚类和注释得到9种主要细胞类型，MGST3在M2样巨噬细胞中表达显著高于M1样，且在AS样本中保持该差异。
**MGST3高表达M2巨噬细胞的功能状态**：MGST3高表达M2样细胞表现出更高的OXPHOS、TCA循环、线粒体翻译和ROS/抗氧化防御模块评分，更低的炎症评分；MGST3与线粒体自噬相关基因（如PINK1、BNIP3、FUNDC1等）表达升高。bulk共表达分析确认MGST3与OXPHOS基因共表达并富集于线粒体模块，bootstrap验证网络稳定。
**MGST3在M2巨噬细胞中的分子机制**：PROGENy显示MGST3高表达细胞中缺氧、TGF-β和VEGF通路活性降低，p53活性升高；炎症相关转录因子（REL、STAT1、TBX21、NFATC1、ETS1、RUNX1）活性降低。scTenifoldKnk虚拟敲低预测影响脂质处理和炎症介质代谢相关基因（FABP5、MIF、CSTB、TPI1、S100A10），GO富集提示不饱和脂肪酸和前列腺素代谢过程。
**MGST3高表达M2巨噬细胞的细胞通讯**：CellChat分析显示MGST3高表达M2细胞传出和传入信号强度均高于低表达组，主要涉及SPP1-CD44、MIF-CD74/CD44、CD99-CD99、MHC-II-CD4等配体受体对以及SPP1、MIF、CD99、MHC-II、GALECTIN等通路。
**MGST3高表达M2状态的疾病水平bulk验证**：ssGSEA显示四个发现数据集中AS样本M2样评分升高；BisqueRNA反卷积结合meta分析显示疾病中resident样和总M2比例增加；七个bulk队列中MGST3高表达M2特征与M2样比例正相关（meta rho=0.47，P<1E-8，I2=10.7%），留一法稳定；独立队列GSE111782中MGST3与M2特征及线粒体模块正相关。
**MGST3相关的线粒体健康**：基于OXPHOS、TCA、线粒体翻译和抗氧化评分减去炎症评分定义复合MitoHealth评分，MGST3高表达组MitoHealth更高，且与MGST3表达正相关（rho=0.40）；独立单细胞流程重跑验证了相关性；基因水平上MGST
