印度烟雾病队列中RNF213 p.R4810K与非p.R4810K变异的鉴定及基因型–表型相关性研究

《Frontiers in Neurology》：Identification and genotype–phenotype correlation of RNF213 p.R4810K and non- p.R4810K variants in Moyamoya disease in an Indian cohort

　　

背景与目的：烟雾病（Moyamoya disease）在东亚人群中已知与环指蛋白213基因变异（RNF213 p.R4810K）相关；然而，在南亚人群中该关联研究较少。本研究旨在鉴定印度烟雾病患者队列中的RNF213 p.R4810K及非p.R4810K变异，并探讨其表型相关性。方法：研究前瞻性纳入100例单侧或双侧烟雾病患者（2023年6月至2024年6月）。采用全外显子组测序（whole exome sequencing, WES）鉴定所有RNF213外显子变异。根据检测到的单核苷酸变异（single-nucleotide variants, SNV）将患者分为RNF213 p.R4810K变异组和非p.R4810K变异组，并依据致病性分类。RNF213 p.R4810K变异进一步分为纯合子（homozygous）和杂合子（heterozygous）。收集人口统计学、临床及血管造影特征。采用Kruskal-Wallis检验和Fisher精确检验评估RNF213多态性与表型特征的统计学相关性。结果：74例（74%）患者未携带RNF213变异，26例（26%）携带RNF213变异。奠基者变异（founder variant）p.R4810K在9例（9%）患者中检出，非p.R4810K变异在19例（19%）患者中检出。5个错义变异被报告为新变异（p.Gln681Glu、p.Pro2875Ser、p.Leu4117Pro、p.Gln4029Arg、p.Asp4003Val）。其中，位于RING结构域的p.Leu4117Pro和p.Asp4003Val被预测会破坏蛋白质结构稳定性。基因型–表型相关性显示，携带p.R4810K和非p.R4810K变异的患者在居住地（p?=?0.006）、烟雾病家族史（p?=?0.001）及脑室周围吻合（periventricular anastomosis, p?=?0.026）方面与未携带者存在显著差异。纯合子与杂合子携带者在临床表现或疾病严重程度上未观察到显著差异。结论：本研究证实RNF213 p.R4810K和非p.R4810K变异均可增加烟雾病风险，并伴有不同的表型表达。未来在大规模队列中开展功能性研究将有助于阐明这些变异在疾病病理生理学中的作用以及更好的基因型–表型相关性。

烟雾病（Moyamoya disease, MMD）是一种罕见的脑血管疾病，以颈内动脉远端进行性狭窄及脑底异常血管侧支网络形成为特征，临床表现从无症状到缺血性及出血性卒中不等，且存在显著的地域差异。环指蛋白213基因（RNF213）的p.R4810K变异已被确认为东亚人群MMD的强易感变异（携带率56%–90%），但在南亚人群中研究极为有限。既往在欧美及东南亚队列中的研究显示该变异罕见或缺失，而非p.R4810K的罕见RNF213变异谱更为广泛。目前，印度烟雾病患者的RNF213变异谱及其基因型–表型相关性尚缺乏系统研究，限制了对该地区疾病遗传结构的理解。

针对上述问题，研究人员开展了一项前瞻性研究，纳入100例经数字减影血管造影（digital subtraction angiography, DSA）确诊的单侧或双侧烟雾病患者（2023年6月至2024年6月），进行全外显子组测序（WES）以系统鉴定RNF213外显子变异，并全面评估变异携带状态与人口统计学、临床及血管造影特征的关联。研究结果表明，印度队列中RNF213变异总携带率为26%，其中奠基者变异p.R4810K仅占9%，非p.R4810K变异占19%；同时鉴定出5个新错义变异，其中位于RING结构域的p.Leu4117Pro和p.Asp4003Val被预测可破坏蛋白质结构稳定性。该研究首次揭示了印度烟雾病患者中RNF213非p.R4810K变异的分布及其与表型的初步关联，为理解烟雾病的遗传异质性和不同人群间的地域差异提供了关键依据。

在关键技术方法方面：研究人员前瞻性纳入100例经DSA确诊的单侧或双侧烟雾病患者（2023年6月至2024年6月，来自印度喀拉拉邦Sree Chitra Tirunal医学科学与技术研究所综合卒中诊疗中心），采集外周EDTA血液提取基因组DNA，采用靶向二代测序在Illumina平台上进行WES（平均深度>80–100×），遵循GATK最佳实践框架及Sentieon工具进行生殖系变异检测，通过VariMAT流程和VEP程序进行变异注释；依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南进行变异致病性分类，利用CADD、Revel、AlphaMissense、PolyPhen-2、SIFT等多种生物信息学工具评估错义变异效应；采用Clustal Omega进行多序列比对以评估氨基酸保守性，使用FoldX v5.1计算蛋白质稳定性变化（ΔΔG）；基因型–表型相关性分析采用Kruskal-Wallis检验（数值变量）和Fisher精确检验（分类变量），多重比较采用Benjamini-Hochberg方法校正。

研究结果如下：

**3.1 人口统计学、临床及血管造影特征**：100例患者中，儿童（<18岁）占61%，成人占39%，平均发病年龄分别为16.14?±?14.64岁和30.31?±?11.72岁。双侧血管病变占87%，缺血性卒中为最常见临床表现（59%），高血压为最常见危险因素（14%）。烟雾病家族史见于4例（4%）患者，62%的患者在发病时存在复发事件。86%的患者Suzuki分期为中度至重度（3–5级），93%存在脑室周围吻合。

**3.2 RNF213 p.R4810K与非p.R4810K变异的鉴定**：在100例先证者中，26例（26%）携带RNF213错义变异，未发现移码或无义突变。奠基者变异p.R4810K在9例（9%）患者中检出，非p.R4810K变异在19例（19%）患者中检出，其中2例携带涉及两种变异的可能复合杂合子。共鉴定出5个新错义变异：p.Gln681Glu位于N端区域，p.Pro2875Ser位于AAA⁺ ATPase结构域，p.Leu4117Pro、p.Gln4029Arg和p.Asp4003Val聚集于C端RING finger结构域附近。FoldX分析显示，位于RING结构域的p.Leu4117Pro和p.Asp4003Val被预测可 destabilize蛋白质结构（ΔΔG正值），其中p.Leu4117Pro的 destabilization效应更强；位于AAA⁺ ATPase结构域的p.Pro2875Ser被预测具有中度 destabilization影响。非p.R4810K变异中，p.Asp4013Asn被分类为可能致病性，p.Thr156Met和p.Gly3523Arg为良性，p.Ala1041Val为可能良性，其余为意义未明变异（variant of uncertain significance, VUS）。11个变异的CADD评分大于20，被认为具有潜在破坏性。

**3.3 RNF213变异与野生型基因型的基因型–表型相关性**：排除2例复合杂合子后，将7例p.R4810K携带者和17例非p.R4810K携带者与74例无变异者进行比较。结果显示，p.R4810K变异携带者主要来自印度西北部各邦尤其是西孟加拉邦（71.4% vs. 28.6%, p?=?0.006），且具有更高的烟雾病家族史阳性率（57.1%, p?=?0.001）和更高的脑室周围吻合评分（p?=?0.026）；非p.R4810K变异携带者则主要来自南部各邦（喀拉拉邦和泰米尔纳德邦，88.2%, p?=?0.006）。血小板计数在三组间也存在显著差异（p?=?0.026）。

**3.4 纯合子与杂合子RNF213 p.R4810K变异的基因型–表型相关性**：将2例纯合子（AA）、7例杂合子（GA）与91例野生型（GG）进行比较。纯合子变异携带者见于居住在泰米尔纳德邦和西孟加拉邦的患者（p?=?0.0006）。然而，纯合子与杂合子携带者在临床表现、血管造影特征（包括大脑后动脉受累、Suzuki分期）及疾病严重程度方面均未观察到统计学显著差异，尽管纯合子患者的脑室周围吻合评分似乎更高。

**3.5 基于致病性的RNF213变异表型特征比较**：排除复合杂合子后，将可能致病性变异（p.Arg4810Lys和p.Asp4013Asn，涉及8例患者）及VUS/良性变异分别与野生型比较，结果表明居住地（p?=?0.012）、阳性家族史（p?=?0.0002）和脑室周围吻合（p?=?0.019）在组间存在显著差异。

在讨论部分，研究人员指出本研究首次系统报道了印度烟雾病患者中RNF213非p.R4810K变异的分布及其基因型–表型相关性。p.R4810K变异存在于所有家族性病例中，而非p.R4810K变异仅见于散发病例，与既往东亚研究一致。显著的地区差异——西孟加拉邦患者携带p.R4810K而南部各邦患者携带非p.R4810K变异——可能与印度北部和南部人群的遗传祖先差异有关：祖源北印度人被认为源自西亚欧亚大陆，而祖源南印度人与印度以外任何群体无关联，加之长期内婚制强化了奠基者效应。5个新变异中，位于RING结构域的变异可能通过影响E3泛素连接酶活性及核因子κB（NF-κB）相关凋亡诱导功能参与MMD发病，而AAA⁺ ATPase结构域变异可能影响蛋白质功能调控。RNF213变异携带者脑室周围吻合评分更高，与Xue等人报道的RNF213在脑室周围区域高表达一致。尽管Fukushima等人描述了纯合子与杂合子之间的基因剂量效应，本研究因样本量有限未观察到二者在临床严重程度上的显著差异。此外，多种生物信息学工具对同一变异的致病性预测存在不一致，反映了不同预测算法和数据库成熟度的差异。研究结论：本研究拓展了对印度人群烟雾病遗传结构的认识，展示了RNF213 p.R4810K与非p.R4810K变异在印度南北地区的表达差异。所鉴定的5个新RNF213变异可能在疾病病理中具有重要临床意义，需进一步功能性验证。p.R4810K与非p.R4810K变异所表达的不同表型特征为理解这些变异在不同信号级联中的作用及烟雾病病理生理学提供了新见解。研究结果强调了在具有烟雾病家族史或早发性脑血管病的家族中开展遗传咨询和级联筛查的必要性。