硫酸乙酰肝素内切硫酸酯酶Sulf1/2调控内侧缰核-脚间核神经回路发育与社交冲突行为

《Frontiers in Neuroanatomy》：Heparan sulfate endosulfatases, Sulf1 and Sulf2, are required for formation of the medial habenula-interpeduncular nucleus circuit

　　

内侧缰核（Medial Habenula, MHb）是位于间脑背侧的缰核内侧亚区，通过后屈束（Fasciculus Retroflexus）向脚间核（Interpeduncular Nucleus, IPN）发出轴突。到达IPN后，MHb轴突多次跨越中线。尽管此前已证实硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan Sulfate Proteoglycans, HSPGs）在MHb轴突导向中发挥作用，但硫酸乙酰肝素6-O-内切硫酸酯酶，即硫酸酯酶1（Sulfatase 1, Sulf1）和硫酸酯酶2（Sulfatase 2, Sulf2）的作用迄今尚未被研究。研究人员因此检测了Sulf1和Sulf2敲除小鼠的MHb轴突轨迹，发现Sulf1/2双敲除（Double Knockout, DKO）小鼠在轴突到达脑腹侧表面后表现出多种寻路错误。这些异常包括向乳头体（Mammillary Body）的异常前伸、在脑表面的异常侧向投射以及IPN内中线交叉的减少。此外，DKO小鼠在管状测试（Tube Test）社交冲突实验中表现出行为结果的改变：与野生型（Wild-Type, WT）小鼠相比，DKO小鼠获胜率更高。这一行为表型可能反映了MHb-IPN神经回路因发育异常而导致的功能力受损。综上所述，这些发现表明Sulf1/2是发育过程中MHb-IPN神经回路正常形成所必需的，而该回路的正常形成对其成年后的正常功能至关重要。

研究背景与意义

缰核（Habenula, Hb）是位于间脑背侧的进化保守结构，接收来自边缘前脑和基底节的输入，并通过后屈束（Fasciculus Retroflexus）向中脑和后脑区域发送输出。缰核由内侧缰核（Medial Habenula, MHb）和外侧缰核（Lateral Habenula, LHb）两个亚核组成，二者在基因表达、连接性和功能方面存在显著差异。MHb轴突主要支配脚间核（Interpeduncular Nucleus, IPN），而LHb轴突投射至中脑和后脑的单胺能核团。MHb-IPN神经回路已被证实与厌恶、应激反应、焦虑样行为、抑郁、药物成瘾及尼古丁依赖密切相关。此外，最近研究表明MHb-IPN回路中的胆碱能传递（Cholinergic Transmission）影响雄性小鼠社交冲突的结果。

硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan Sulfate Proteoglycans, HSPGs）存在于细胞表面和细胞外基质中，通过硫酸乙酰肝素（Heparan Sulfate, HS）糖链与多种信号分子和受体相互作用，调控轴突导向等多个神经发育方面。HS的硫酸化模式由磺基转移酶（Sulfotransferases）生成，随后由HS内切硫酸酯酶（HS Endosulfatases）重塑，决定了HS-蛋白质相互作用的特异性和亲和力。HS内切硫酸酯酶Sulfatase 1（Sulf1）和Sulfatase 2（Sulf2）通过从成熟HS链上胞外去除6-O-硫酸基团（6-O-Sulfate Groups），正向或负向调节多种细胞信号通路。研究人员此前利用Sulf1/2双敲除（Double Knockout, DKO）小鼠的研究已表明Sulf1/2在皮质脊髓束（Corticospinal Tract）、胼胝体（Corpus Callosum）和背侧海马连合（Dorsal Hippocampal Commissure）形成中发挥重要作用。Sema5A对MHb轴突的作用受HSPGs和硫酸软骨素蛋白聚糖（Chondroitin Sulfate Proteoglycans, CSPGs）调控：表达于MHb轴突表面的HSPGs是Sema5A介导的吸引作用所必需的，而富集于MHb轴突轨迹周围的CSPGs则将Sema5A从吸引性导向信号转变为排斥性导向信号。尽管此前研究已表明HSPGs参与MHb轴突导向，但Sulf1/2的作用仍不清楚。因此，开展本研究旨在阐明Sulf1/2在MHb-IPN神经回路形成中的功能。

关键技术方法

本研究采用了以下主要技术方法：利用Sulf1和Sulf2敲除小鼠模型（Sulf1^tm1Mmas和Sulf2^tm1Mmas），通过Sulf1^?/?; Sulf2^+/?小鼠交配获得DKO胚胎，以Sulf1单敲除小鼠作为同窝对照。对成年小鼠和胚胎期第17.5天（Embryonic Day 17.5, E17.5）胚胎进行灌注固定和脑切片制备。通过免疫组织化学（Immunohistochemistry）染色检测胆碱乙酰转移酶（Choline Acetyltransferase, ChAT）标记胆碱能纤维、Robo3标记发育中的MHb轴突以及Pax7标记IPN神经元。采用生物素化葡聚糖胺（Biotinylated Dextran Amine, BDA）单侧立体定位注射进行MHb纤维顺行示踪（Anterograde Tracing），并结合亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（Avidin-Biotin-Peroxidase Complex, ABC）和3,3′-二氨基联苯胺（3,3′-Diaminobenzidine, DAB）显色。利用AutoAligner和Imaris软件进行三维重建（3D Reconstruction）。采用管状测试（Tube Test）评估社交冲突行为，以二项广义线性混合模型（Binomial Generalized Linear Mixed Model, GLMM）进行统计分析，辅以Mann–Whitney U检验和Pearson相关系数分析。成年DKO和WT小鼠分析在C57BL/6N与CD-1/ICR混合遗传背景上进行，样本量为WT小鼠8只、DKO小鼠8只。

研究结果

成年Sulf1/2 DKO脑中内侧缰核胆碱能神经元的异常投射

通过对成年小鼠脑进行ChAT免疫染色，检测MHb腹侧亚区胆碱能神经元的轴突投射。在WT小鼠中，胆碱能纤维经后屈束延伸至IPN，并在IPN内形成密集支配。在DKO小鼠中，后屈束形成正常，但部分纤维在接近脑腹侧表面时出现侧向偏离，且在IPN水平可见后屈束解束（Defasciculation），在脑表面形成与动眼神经（Oculomotor Nerve）纤维重叠的粗大侧向投射束。这些异常纤维停留在IPN附近的脑表面，无进一步投射。IPN内胆碱能纤维分布沿背腹轴略显扭曲和扁平。此外，在乳头体（Mammillary Body）中也观察到异常纤维。Sulf1或Sulf2单敲除小鼠均未显示胆碱能纤维投射异常。三维重建图像进一步证实，DKO脑中IPN沿前后轴和背腹轴均尺寸缩小，腹侧中脑表面可见侧向误导纤维。

Sulf1/2 DKO脑中MHb纤维中线交叉和再交叉缺陷

通过向单侧MHb立体定位注射BDA进行顺行示踪，结合三维重建。在WT脑中，BDA标记纤维向中线延伸并终止于IPN内。在DKO脑中，标记纤维在到达脑腹侧表面之前解束，呈双侧分布于脑表面。三维重建清晰显示两类异常纤维：沿对侧脑腹侧表面延伸的中线交叉纤维和沿同侧脑腹侧表面延伸的未交叉纤维。为评估中线交叉模式，对E17.5胚胎进行Robo3免疫染色。在对照（Sulf1 KO）胚胎中，三维重建显示MHb纤维在IPN内有3–4处以束状跨越中线。而在DKO胚胎中，IPN内仅有1–2处中线交叉位点，同时观察到异常MHb纤维侵入乳头体和沿中脑腹侧表面延伸，与成年DKO小鼠表型一致。

Sulf1/2 DKO脑中IPN神经元的异位分布

鉴于ChAT免疫染色显示IPN形态异常，研究人员通过ChAT和Pax7（IPN神经元标志物）双重免疫染色检测IPN神经元分布。在WT脑中，Pax7阳性神经元局限于IPN内，IPN外未见分布。在DKO小鼠中，虽然大量Pax7阳性神经元仍位于IPN内，但部分神经元异位定位于核团之外，沿脑表面排列，且这些异常分布的Pax7阳性神经元与误导的MHb纤维重叠。

Sulf1/2 DKO小鼠在管状测试中社交结果的改变

采用管状测试评估社交冲突行为。在WT与DKO配对的128场比赛中（仅1场平局），对127场确定胜负的比赛进行分析。结果显示，DKO小鼠的获胜概率显著高于WT小鼠（WT为0.179，DKO为0.857），表明DKO小鼠在社交冲突中表现出降低的失败倾向。定性观察发现，DKO小鼠在面对对手时倾向于持续抵抗而非主动推回，其较高的获胜率并非伴随更强的攻击行为。DKO小鼠体重显著低于WT小鼠，但在同基因型比赛中，体重排名与胜率之间无显著相关性，提示获胜概率差异不太可能仅归因于体重。

讨论总结

本研究表明Sulf1/2在MHb至IPN神经回路形成中发挥重要作用。DKO小鼠后屈束形成正常，说明Sulf1/2并非Sema5A介导的HSPGs依赖性MHb轴突吸引所必需。然而，在脑腹侧区域观察到三类显著的MHb纤维异常：侵入乳头体、沿中脑表面侧向延伸以及IPN内中线交叉异常。结合Sulf1/2在放射状胶质细胞（Radial Glial Cells）中沿第三脑室和导水管室管区共表达、Sulf1/2蛋白被运输至脑腹侧表面，以及DKO小鼠此前在锥体交叉（Pyramidal Decussation）、胼胝体和背侧海马连合中显示的中线交叉缺陷，提示Sulf1/2可能在调控中线交叉方面具有更广泛的功能。行为学层面，斑马鱼背侧缰核-IPN通路和小鼠MHb-IPN通路均促进失败行为，DKO小鼠在管状测试中获胜概率升高可解释为MHb-IPN回路发育异常导致的失败反应受损。MHb轴突在IPN内沿其轨迹形成往返突触（En Passant Synapses），DKO小鼠的轴突缺陷可能限制其与IPN神经元的突触接触范围，从而为MHb轴突在IPN内反复中线交叉的功能意义提供见解。关于IPN神经元异位分布，MHb轴突缺陷和神经元迁移可能是独立的缺陷事件，也可能MHb轴突影响了迁移中IPN神经元的目的地。分子机制方面，DKO脑中MHb轴突缺陷与先前报道的皮质脊髓束缺陷均位于中脑表面，提示共同机制。鉴于HS超硫酸化导致Slit2蛋白在软膜表面异常积累从而排斥皮质脊髓轴突，而Slit-Robo信号在MHb轴突导向中起关键作用，异常Slit2积累可能是导致MHb轴突异常延伸的原因，但不能排除其他轴突导向分子的参与。

研究结论（翻译）

综上所述，这些发现表明Sulf1/2是发育过程中MHb-IPN神经回路正常形成所必需的，而该回路的正常形成对其成年后的正常功能至关重要。