**中文标题：农业食品残渣的发酵增值：基于响应面法优化副干酪乳杆菌植物亚种（*Lactiplantibacillus paraplantarum*）发酵条件生产平台有机酸**

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Fermentative valorisation of agri-food residues: optimisation of Lactiplantibacillus paraplantarum fermentation conditions for the production of platform organic acids

　　

**引言：** 有机酸发酵是将第二代（2G）生物质整合到生物精炼厂中，并促进农业食品残渣与平台化学品生产之间工业共生关系的关键途径。然而，番茄皮渣（tomato pomace，TP）和废咖啡渣（spent coffee grounds，SCG）等植物基质表现出有限的碳可及性，并含有可能抑制细菌生长的酚类化合物和脂质化合物。

**方法：** 本研究采用经氢醇预处理的TP，并开发了一种迭代策略，利用副干酪乳杆菌植物亚种（*Lactiplantibacillus paraplantarum*）作为生物工厂进行有机酸生产，同时评估其对乳酸盐的选择性。采用定量质子核磁共振（quantitative proton nuclear magnetic resonance，q-¹H NMR）监测乳酸（lactic acid，LA）和乙酸（acetic acid，AA）的滴度以及这些酸的表观葡萄糖当量转化率（apparent glucose-equivalent conversion，aGEC）。由于aGEC包含了缓冲液来源的醋酸盐，它是一个比较性的、非化学计量学的指标，而非封闭的碳产率。

**结果与讨论：** 响应面法（response surface methodology，RSM）确定了44.7%的TP替代率、79.6小时和初始pH 5.77作为基础发酵条件（LA为4.73 ± 0.26 g^-1L^-1；aGEC ≈ 6%）。氮源优化和pH缓冲分别将LA提高至7.68 ± 0.56和14.52 ± 0.76 g^-1L^-1，aGEC分别提高至≈ 10%和≈ 26%。最终的组合强化处理包括纤维素酶预处理、改良的孵育气氛和添加CaCO₃作为额外缓冲系统。该处理将aGEC提高至≈ 85%，但并未显著增加LA产量。醋酸盐大量积累，且同时进行的多项修改使得无法将响应归因于任何单一因素。将针对TP优化的基础条件转移到SCG仅在中等替代水平下可行。在44%–60%的标准葡萄糖替代率下，SCG维持了约28%–29%的可比aGEC值，并产生了16.92–15.87 g^-1L^-1的LA，而更高的替代率则同时降低了aGEC和LA产量。这一顺序框架区分了总酸积累与LA选择性，并显示了残渣特异性发酵条件的有限可转移性。

**论文解读**

**一、研究背景与现存问题**

在可利用自然资源有限以及价值链脱碳需求的双重驱动下，传统工业部门正寻求利用可再生生物质资源替代化石原料来获取平台化学品，如有机酸、醇类和聚合物前体。第二代（2G）生物质因不与食物供应直接竞争而备受关注，其中番茄皮渣（TP）和废咖啡渣（SCG）是两种产量巨大且具代表性的农业食品残渣。然而，这两类基质均面临显著的技术挑战：一是其致密的木质纤维素结构导致碳源可及性差，需要预处理才能释放可发酵糖；二是基质中富含的酚类化合物和脂质组分可能抑制微生物的生长与代谢。此外，与基于第一代（1G）生物质或深度预处理的木质纤维素生物质所能达到的超过100 g^-1L^-1的乳酸（LA）滴度相比，利用TP和SCG进行有机酸发酵的研究尚不充分，其明确的适宜操作范围尚未建立。虽然已有关于TP发酵的研究，但尚不确定顺序优化是否能有效区分高固含量TP培养基中的营养限制、pH相关限制和底物可及性限制，也不清楚由此获得的基础条件能否适用于其他2G基质。因此，本研究旨在填补这些空白，探索将TP提取生物活性化合物后的固体残渣作为发酵原料，纳入级联生物精炼流程。

**二、研究目标与技术方法概述**

本研究的主要目标是：(i) 优化异型发酵细菌——副干酪乳杆菌植物亚种（*Lactiplantibacillus paraplantarum*，CECT 5783）利用预处理TP生产平台有机酸（乳酸和乙酸）的发酵参数；(ii) 评估所得优化基础发酵条件向另一种复杂2G生物质SCG的转移性。研究采用了一种顺序优化框架，将基础条件优化与过程强化区分开来。关键的技术方法包括：对TP和SCG进行氢醇（乙醇）预处理以降低酚类负荷；通过预筛选（评估碳源量、接种量和初始pH对菌株生长和产酸的影响）确定响应面法（RSM）的实验域；以中心复合设计（CCD）结合RSM优化葡萄糖替代率（因素A）、发酵时间（因素B）和初始pH（因素C）；采用定量质子核磁共振（q-¹H NMR）技术直接定量复杂发酵液中的乳酸（LA）和乙酸（AA）。研究中使用了表观葡萄糖当量转化率（aGEC）作为比较性指标，其计算公式为aGEC (%) = 100 × ([LA] + [AA])/81.88 g^-1L^-1。

**三、主要研究结果与讨论**

**3.1 预处理番茄皮渣的组成**
经氢醇提取并干燥的TP显示出高干物质含量（96% ± 1%）和丰富的纤维含量（占总组成的92% ± 5%），其中可溶性纤维为59% ± 7%，不溶性纤维为28% ± 2%。其脂肪和蛋白质含量较低（均为2.0%左右），灰分含量中等（4.0% ± 0.4%）。约26% ± 4%的潜在可发酵碳水化合物被视为纤维富集碳水化合物库的一部分。该组成表明，乙醇提取预处理最大限度地减少了对细菌稳态的干扰，但也揭示了其低蛋白含量所暗示的氮缺乏问题，为后续氮源优化提供了依据。

**3.2 顺序优化副干酪乳杆菌植物亚种生产有机酸**

**3.2.1 预筛选**
通过24孔板预筛选，研究人员评估了葡萄糖输入量、接种量和初始pH的影响。根据高生长量（log₁₀净增活菌数≥7.4）和强酸化能力（最终pH≤5.0）的双重标准，选择了三个适宜的孔位（W8、W1、W9）。这些条件的初始pH范围在5.3–5.8，最终pH在4.5–5.0。此结果确定了后续CCD实验的边界，即初始pH 5.3–6.3，接种量5%（v/v），葡萄糖浓度相当于81.9 g^-1L^-1，确保了在碳饱和条件下进行优化。

**3.2.2 响应面法优化**
以LA产量（g^-1L^-1）为响应变量，对葡萄糖替代率（A）、时间（B）和初始pH（C）进行CCD实验。通过ANOVA分析，获得的简化二次模型具有显著拟合度（F = 30.91；p < 0.0001；R² = 0.9755）且失拟项不显著。模型项包括时间（B）、初始pH（C）、时间与pH的交互项（BC）、替代率的二次项（A²）和pH的二次项（C²）。该模型揭示了LA产量在一个中等pH（约5.5–6.5）区域存在最优值，且高替代率（>70%）和长时间（>80 h）对提高产量作用有限。实验验证显示，数值最优条件（A = 44.7%，B = 79.6 h，C = 5.77）产生的LA为4.73 ± 0.26 g^-1L^-1，与模型预测值4.68 g^-1L^-1高度接近。该结果表明，在无氮源补充和pH控制时，系统主要受抑制作用限制，而非碳源可利用性。

**3.2.3 氮源优化**
在RSM最优条件下，研究人员考察了不同氮源（有机氮、无机氮及混合氮）及其与碳源的质量比对发酵的影响。结果显示，仅含无机氮（(NH₄)₂SO₄）的处理LA产量仅为1.42–1.62 g^-1L^-1，而添加有机氮源（蛋白胨和酵母提取物）显著提升了LA产量至5.12–7.68 g^-1L^-1。最优处理（S4）的LA产量为7.68 ± 0.56 g^-1L^-1，aGEC约为10%。这表明，*L. paraplantarum*存在明显的营养缺陷型，有机氮源所提供的氨基酸、维生素和辅因子等对细胞生长和代谢至关重要。

**3.2.4 pH缓冲与外源乳酸补充**
此阶段在选定最佳氮源配方的基础上，评估了pH缓冲（醋酸盐缓冲液）和外源LA添加的影响。结果表明，pH控制是实现强化的最有效因素。在初始pH为5.8时，使用醋酸盐缓冲液使LA产量翻倍至14.52 ± 0.76 g^-1L^-1，aGEC约为26%，而初始pH为4.5时LA产量为9.84 ± 0.13 g^-1L^-1。外源LA的添加实验显示，随着外源LA浓度从2.58增加到7.68 g^-1L^-1，内源性LA产生量呈梯度下降，表明产物抑制效应存在，且这种抑制作用在较低pH条件下更为显著。

**3.3 组合过程强化与产物分布**
在确定的缓冲基础条件下（LA为14.52 g^-1L^-1），研究人员进一步结合了超声-纤维素酶预处理、改良孵育气氛（有氧、厌氧、微需氧）和CaCO₃额外缓冲。由于所有因素在同一阶段被同时修改，且未设置仅添加CaCO₃的基础对照组，各因素的单独贡献无法被区分。结果显示，最终组合处理的LA平均滴度数值上提升至16.83–20.50 g^-1L^-1，但并未显著增加；而AA浓度则大幅上升至40.0–62.5 g^-1L^-1，aGEC显著增至约85%。该结果表明，最终阶段的主要成果是增加了总酸积累，但乙酸主导了酸谱，LA仅占定量酸池的约25%–30%。此结果将代谢选择性而非单纯的可发酵性确定为关键限制因素。

**3.4 从番茄皮渣到废咖啡渣的条件转移性**
将针对TP优化的基础条件（包括氮源配方和pH缓冲）直接应用于氢醇预处理的SCG，结果表明该条件仅在中等替代水平下有效。在44%和60%的标准葡萄糖替代率下，SCG的LA产量分别达到16.92 ± 0.20和15.87 ± 0.44 g^-1L^-1，aGEC约为28%和29%。然而，当替代率超过60%时，LA产量和aGEC均出现下降，显示出底物顽抗性和残余抑制作用成为了主要限制因素。这表明，特定残渣的发酵条件向另一种残渣的转移是有限的，仅在碳可及性、残余抑制和pH稳定性都可控的特定替代率范围内可行。

**3.5 核磁共振监测有机酸**
本研究采用q-¹H NMR对复杂发酵液中的LA和AA进行定量监测。以DMSO作为内标（2.2 g^-1L^-1），其信号（2.7 ppm）与LA/乳酸根（1.30–1.35 ppm）和AA/乙酸根（1.95–2.05 ppm）的共振峰分离良好，可直接积分定量。对未处理和离心澄清的发酵液进行分析所得结果一致，支持了该方法用于常规监测的可行性。DMSO积分分布的分析显示，随着实验流程的标准化，该方法的操作可重复性在后期实验组中得到了改善。

**四、结论与意义**

在实验室条件下，氢醇预处理的TP和SCG均可作为*L. paraplantarum*发酵生产有机酸的底物，实现了级联生物精炼。对于TP，顺序优化策略确定了基础条件为：初始pH 5.79、氮源与碳源质量比0.75、蛋白胨与酵母提取物比例3:2。pH缓冲使LA产量提高至14.52 ± 0.76 g^-1L^-1。最终组合强化处理使aGEC达到约85%，但由于乙酸主导了酸谱，LA选择性成为限制因素。TP来源的基础条件用于SCG时，仅在44%–60%的葡萄糖替代率下有效。研究的主要贡献在于提出了一个顺序优化框架，该框架能够区分总酸积累与LA选择性，并证明了基础发酵条件在两种残余生物质之间的有限可转移性。未来的工业应用需要可控pH的放大研究、更有效的碳水化合物释放技术、下游回收工艺以及技术经济评估。