《Frontiers in Molecular Neuroscience》：3-hydroxy-3-methylbutyrate (3H3MB) suppresses glioma growth and extends survival in mice
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胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，以预后差、治疗选择有限和高复发率为特征。导致其临床结局不佳的主要因素之一是胶质母细胞瘤细胞的高度侵袭性，这些
胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，以预后差、治疗选择有限和高复发率为特征。导致其临床结局不佳的主要因素之一是胶质母细胞瘤细胞的高度侵袭性，这些细胞浸润周围健康的脑实质，使手术完全切除无法实现，并促进治疗耐药。新出现的证据表明，肠道菌群通过调节神经递质信号传导和免疫应答，以及通过改变微生物组成和影响肿瘤发展的代谢产物产生，来影响胶质母细胞瘤的进展。基于研究人员先前证实肠脑轴在生理和胶质瘤背景下均具有相关性的工作，研究人员发现，与荷瘤前状态相比，荷瘤小鼠粪便中3-羟基-3-甲基丁酸（3-hydroxy-3-methylbutyrate, 3H3MB）的水平显著降低。3H3MB是一种肠道相关的亮氨酸衍生代谢物，在化学和代谢特性上均不同于短链脂肪酸丁酸（butyrate）。鉴于已有文献报道给予3H3MB可抑制癌模型中的生长和增殖，研究人员探究了其在胶质瘤中潜在的抗肿瘤效应。在体内，对荷瘤小鼠经口灌胃给予3H3MB，与对照动物相比，可导致肿瘤体积显著缩小、细胞增殖减少，并延长总生存期。在体外，3H3MB显著抑制小鼠胶质瘤和人胶质母细胞瘤细胞系的增殖，并调节细胞周期各时相；此外，该处理抑制了胶质瘤细胞迁移和血清诱导的侵袭。这些发现表明，3H3MB在荷瘤小鼠中发挥强大的抗肿瘤作用，并有望成为胶质母细胞瘤的一种新型代谢疗法，且其已在其他病理条件下的临床评估中得到支持。
胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最常见且最致命的成人原发恶性脑肿瘤，其具有高度异质性、侵袭性以及易复发等特点，目前标准治疗手段包括手术、放疗和替莫唑胺化疗，但受限于肿瘤浸润和血脑屏障，疗效仍不理想。近年来肠道菌群及其代谢物被发现可影响脑功能和肿瘤进展，但胶质瘤与肠道菌群之间的关联仍未充分阐明。研究人员前期发现，在胶质瘤小鼠模型中粪便代谢谱发生改变，其中3-羟基-3-甲基丁酸（3H3MB）水平显著降低。3H3MB是一种肠道相关亮氨酸衍生代谢物，与丁酸在化学和代谢上有所不同。已有研究表明3H3MB在癌模型中具有抑制生长和增殖的作用，且其口服补充在动物实验中可改善脑功能。基于此，研究人员系统研究了3H3MB对胶质瘤的抗肿瘤效应及机制，以探索其作为胶质母细胞瘤代谢疗法的潜力。研究结果显示，3H3MB无论是在肿瘤接种前还是接种后一周开始给药，均可显著缩小GL261和SB-28小鼠胶质瘤模型的肿瘤体积，降低肿瘤细胞增殖，并延长总生存期；体外实验表明，3H3MB能抑制小鼠胶质瘤和人胶质母细胞瘤细胞系活力，诱导细胞周期阻滞，抑制细胞迁移和胎牛血清诱导的侵袭，且不影响正常星形胶质细胞，Annexin V/PI染色显示其不诱导明显凋亡，提示主要发挥细胞抑制（cytostatic）作用。这些发现证明3H3MB可通过抑制增殖、迁移和侵袭来抑制胶质瘤生长，并延长荷瘤小鼠生存期，为胶质母细胞瘤治疗提供了新的代谢干预策略。由于3H3MB已在肌肉萎缩、癌症恶病质等疾病中获得临床安全数据，将其应用于胶质瘤治疗具有较好的转化前景。
研究人员主要采用以下关键技术方法。动物实验使用雄性C57BL/6N小鼠，分别立体定向接种GL261和SB-28胶质瘤细胞构建同系小鼠模型；粪便代谢组学采用基于质子核磁共振（1H-NMR）的代谢谱分析，结合主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）等多元统计方法鉴定差异代谢物。治疗实验通过口服灌胃给予3H3MB（76 mg/kg/天），对照给予PBS。细胞实验包括MTT法检测活性、流式细胞术分析细胞周期（碘化丙啶染色）、伤口愈合实验评估迁移、FluoroBlok? transwell侵袭实验评估侵袭，以及Seahorse细胞外通量分析检测线粒体呼吸和糖酵解。肿瘤体积通过苏木精-伊红（H&E）染色切片计算，增殖通过免疫荧光Ki67染色评估，生存分析采用Kaplan–Meier曲线。
3.1 荷瘤小鼠粪便中3-羟基-3-甲基丁酸（3H3MB）水平降低
通过1H-NMR代谢组学对25只健康小鼠进行粪便代谢物分析，并在3周后对其中15只接种胶质瘤细胞（Glioma）和10只进行假手术（Sham）的小鼠再次分析。Venn图和单变量分析显示，与健康对照相比，荷瘤小鼠粪便中3H3MB浓度显著降低，表明胶质瘤生长与肠道相关代谢物的改变有关。
3.2 3H3MB预处理显著减少两种小鼠模型的胶质瘤体积
采用GL261和免疫原性较低的SB-28同系小鼠胶质瘤模型，在肿瘤细胞接种前2周开始口服3H3MB（76 mg/kg/天）持续5周。结果显示，与PBS对照组相比，3H3MB预处理使GL261模型肿瘤体积从45.20±4.19 mm3降至29.32±3.90 mm3（p=0.0135），SB-28模型从38.20±4.37 mm3降至21.00±3.91 mm3（p=0.0110），证明3H3MB能干扰胶质瘤的早期形成。
3.3 治疗性3H3MB治疗缩小肿瘤体积、降低增殖并延长两种荷瘤小鼠模型的生存期
在肿瘤接种1周后开始给予3H3MB，模拟已确立肿瘤的治疗场景。结果显示，GL261模型肿瘤体积从11.90±1.67 mm3降至7.27±0.16 mm3（p=0.0202），SB-28模型从68.52±6.19 mm3降至36.18±3.77 mm3（p=0.0008）。Ki67免疫荧光显示3H3MB处理组增殖细胞显著减少。Kaplan–Meier生存分析表明，3H3MB治疗使GL261荷瘤小鼠中位生存期从27天延长至33天（p=0.0040），SB-28从20天延长至22天（p=0.0228），表明其具有治疗活性并延长生存期。
3.4 3H3MB降低胶质瘤细胞活力并调节细胞周期进程
在多个小鼠（GL261、CT2a、SB-28）和人（U-87 MG、GL-15）胶质瘤细胞系中，3H3MB（100 μM、250 μM）处理显著降低细胞活力，最早在24小时（人源）或48小时（鼠源）出现明显效应，且不影响正常人星形胶质细胞。流式细胞术显示，GL261和SB-28细胞经3H3MB处理后，G0/G1期比例减少，S期和G2/M期比例增加。Seahorse分析发现GL261细胞耗氧率和胞外酸化率显著改变，SB-28无显著变化；Annexin V/PI染色未检测到明显凋亡，提示3H3MB主要发挥细胞抑制效应。
3.5 3H3MB抑制小鼠和人胶质瘤细胞迁移与侵袭
伤口愈合实验显示，在羟基脲阻断增殖的条件下，3H3MB（500 μM）处理24和48小时后，小鼠（GL261、SB-28）和人（U-87 MG、GL-15）胶质瘤细胞系的伤口闭合面积均显著低于对照组。Transwell侵袭实验表明，3H3MB处理可显著抑制GL261和GL15细胞在胎牛血清趋化下的侵袭细胞数，提示3H3MB具有抑制胶质瘤迁移和侵袭的能力。
讨论与结论
讨论部分指出，3H3MB为肠道菌群相关代谢物，其在荷瘤小鼠粪便中的降低提示胶质瘤可重塑宿主-微生物代谢相互作用。3H3MB在骨骼肌中具有促进蛋白合成和线粒体生物发生等合成代谢功能，在肿瘤模型中可抑制肿瘤生长。本研究发现3H3MB降低胶质瘤细胞活力具有细胞系普遍性，且不影响正常星形胶质细胞，提示其具有肿瘤选择性。细胞周期分析和凋亡检测表明其抗增殖作用主要通过细胞周期阻滞实现，而非诱导凋亡。Seahorse代谢分析显示糖代谢重编程在GL261细胞中可能为适应性变化，而非必需机制。此外，3H3MB可能通过免疫调节途径增强抗肿瘤免疫，但尚需阐明。其临床转化价值在于已作为膳食补充剂用于恶病质等疾病，安全性明确，且可口服、能进入循环并可能透过血脑屏障，因此有望成为胶质母细胞瘤的辅助治疗。但研究也存在局限性：3H3MB的肠道微生物来源尚未直接证实，分子机制仍不明确，肿瘤导致的3H3MB降低是因果还是伴随现象未知，免疫介导作用、患者异种移植模型验证和联合治疗效能有待未来研究。
结论：本研究数据表明，3H3MB作为肠道菌群相关且宿主来源的亮氨酸代谢物，在胶质瘤中发挥强效抗肿瘤作用，抑制增殖、迁移和侵袭，减小肿瘤体积并延长体内中位生存期。这些发现拓展了对胶质瘤中肠脑互作的理解，并将3H3MB确定为有前景的治疗候选物。通过桥接微生物组科学与神经肿瘤学，该工作为开发以微生物群和代谢为靶点的策略来改善胶质母细胞瘤患者结局奠定了基础。
