**栓皮栎（*Quercus suber*）与圆叶栎（*Quercus rotundifolia*）木栓形成层寿命差异相关联的木栓层（phellem）细胞模式对比研究**

《Trees》：Contrasting phellem patterns associated with phellogen longevity in Quercus suber and Quercus rotundifolia (Fagaceae)

　　

**摘要**

关键信息：维持持久的木栓形成层（不产生落皮层）可能与径向垂周细胞分裂速率随枝条直径增加而升高有关，而当木栓形成层被替换并形成落皮层时，则观察到相反趋势。

栓皮栎（*Quercus suber* L.）终生保持其第一个木栓形成层（栓皮形成层）的活性，这与圆叶栎（*Quercus rotundifolia* Lam.）及许多其他树种不同——后者的第一个木栓形成层最终被替换并形成落皮层。由于周皮个体发育提供了过去细胞分裂活动的空间记录，研究人员开发了一种定量图像分析工作流程，以比较两个物种幼枝中木栓层的细胞模式，作为木栓形成层径向垂周细胞分裂频率的解剖学代理指标。对栓皮栎和圆叶栎枝条的样本水平分析显示，枝条直径与从木栓层行列数推断的径向垂周细胞分裂频率（Div/10c）之间的关系在物种间存在显著差异（物种×直径交互作用）：栓皮栎的Div/10c随直径增加而升高，而圆叶栎则无此趋势，且在直径≥7 mm的枝条中差异最为明显。在该尺寸类别中，栓皮栎枝条还表现出更高的木栓层细胞密度。这些发现为两种栎属物种木栓层组织的差异提供了早期解剖学证据，这种差异可能最终导致它们截然不同的周皮发育策略。

**论文解读**

**研究背景与科学问题**

树木的次生生长由两种侧生分生组织驱动：维管形成层（vascular cambium）产生次生木质部（木材）和次生韧皮部；木栓形成层（phellogen，即栓皮形成层）向内产生栓内层（phelloderm），向外产生木栓层（phellem，即软木）。三者共同构成周皮（periderm），作为植物次生体的保护屏障，抵御生物与非生物胁迫，并调节与外界的水分和气体交换。

木栓形成层的寿命在不同树种间差异很大。多数树种在经历若干个生长季后，第一个木栓形成层会崩溃并被新的分生组织层取代，形成落皮层（rhytidome）或外树皮。圆叶栎（*Quercus rotundifolia* Lam.）遵循这一常见模式，相对较早地替换其第一个木栓形成层。与之形成鲜明对比的是，栓皮栎（*Quercus suber* L.）在整个树的生命周期中保持同一木栓形成层环的活性，产生极其深厚且具有商业价值的木栓层。尽管Hooke在1665年对软木的观察在细胞生物学史上具有重要意义，但支撑栓皮栎木栓形成层终生活性的细胞机制在很大程度上仍未被表征。在维管形成层中，径向垂周细胞分裂（radial anticlinal cell division）使形成层环能够随着次生生长中茎干周长的增加而扩张其圆周。类似机制已被提出可能存在于栓皮栎的木栓形成层中，但从未被正式量化，也未与具有非持久性木栓形成层的近缘种进行比较。细胞分裂平面的定向受植物分生组织中基因的严格控制，周缘分裂（periclinal division）与径向垂周分裂之间的平衡决定了器官的几何形状和生长。

栓皮栎和圆叶栎同属欧亚栎属（*Quercus*）Cerris亚属，但分属不同组：栓皮栎归入Cerris组，圆叶栎归入Ilex组。尽管存在这种组间分离，两物种在共生区域可自然杂交，产生具有中间形态特征的杂种。两种物种都是伊比利亚半岛西部地中海生态系统中的特征性结构要素，常在同一景观中共同出现，但表现出截然不同的树皮和周皮策略：栓皮栎维持单一持久木栓形成层，而圆叶栎通过连续的木栓形成层替换发育出典型的落皮层。

**研究目的与假设**

本研究假设：相对于圆叶栎，栓皮栎木栓形成层中更高频率的径向垂周细胞分裂所对应的木栓层细胞模式，在幼枝中应已可检测到。为验证这一假设，研究人员开发并应用了一种定量图像分析工作流程，沿枝条直径发育梯度，表征两种物种木栓层中的组织模式参数——包括径向垂周细胞分裂频率的解剖学代理指标、细胞密度和细胞大小。

**主要技术方法**

研究人员于2022年秋季和2023年春季，从葡萄牙南部阿连特茹（Alentejo）天然栎树林地中采集1–3年生、直径2.1–15 mm（总体均值7 mm）的枝条样本。每个采样树采集一个枝条，立即切成2 mm小段进行组织学处理。最终分析共36个枝条样本：19个来自栓皮栎，17个来自圆叶栎。样本经FAA固定、梯度乙醇脱水、树脂包埋后，用旋转切片机切取6–8 μm横切片，甲苯胺蓝染色，在明场和UV荧光模式下观察（利用木栓化木栓层细胞的自身荧光）。图像分析在ImageJ Fiji中执行半自动化流程，包括多边形选择、掩膜生成、亮度/对比度优化、模糊滤波、LUT反转、局部阈值分割、分水岭分割及手动校正。每个图像定义200×200 μm标准化研究区域，记录参数包括总细胞密度（每40,000 μm2）、平均细胞大小（μm2）、平均每列细胞数、外行细胞数、内行细胞数、径向垂周分裂次数及每10个细胞的径向垂周分裂次数（Div/10c）。Div/10c通过公式[(内行细胞数?外行细胞数)/外行细胞数]×10计算，作为过去径向垂周细胞分裂频率的回顾性解剖学特征。统计上采用线性模型检验物种×直径交互作用，双因素ANOVA用于分类比较，Pearson相关和普通最小二乘（OLS）回归分别用于各物种内量化关系，Mann-Whitney U检验用于配对比较，置换检验和bootstrap重采样（各10,000次迭代）评估交互项的稳健性。

**主要研究结果**

**木栓层模式反映发育时间**

次生生长产生了反映发育时间的空间梯度：在木栓层中，外侧（较老）细胞完全分化，而紧邻木栓形成层的细胞处于分化早期。木栓层细胞模式提供了木栓形成层细胞分裂活动沿径向轴的回顾性记录。在分析的幼枝中，显微镜下两个物种的周皮细胞相似，均显示清晰勾勒的、具有规则柱状排列的自荧光木栓层细胞，其下方为界限分明的木栓形成层。然而，栓皮栎木栓层中可见更多指示过去径向垂周细胞分裂的特征。量化分析显示，总体而言栓皮栎的细胞密度有高于圆叶栎的趋势（86.50±54.10 vs. 47.35±9.52个/40,000 μm2；Mann-Whitney p=0.071），但未达显著水平，这反映了直径效应驱动的种内大方差。平均细胞大小在物种间总体相当（71.34±21.27 vs. 67.52±12.17 μm2；p=0.727）。考虑枝条直径后，在≥7 mm组中差异变得更为显著：栓皮栎的细胞密度显著高于圆叶栎（98.12±52.28 vs. 47.71±12.78；p=0.021），而<7 mm组无显著差异。这一模式与较大栓皮栎枝条中木栓形成层分生组织活性增强、产生更多细胞相一致。

**跨直径梯度的物种特异性径向垂周分裂频率差异**

关键发现涉及以Div/10c表示的径向垂周细胞分裂频率。当枝条直径作为连续变量分析时，物种×直径交互作用高度显著（β交互=0.551，p=0.0005），表明枝条直径与Div/10c之间的关系在物种间差异强烈。各物种分列回归揭示了相反的物种特异性趋势：栓皮栎的Div/10c随直径增加而升高（β=0.364/毫米，Pearson r=0.60，p=0.006，R2=0.365），而圆叶栎的Div/10c随直径增加而降低（β=?0.183/毫米，r=?0.53，p=0.029，R2=0.280）。以数据平均直径（7 mm）为阈值的次级分类分析支持相同趋势，物种×直径类别交互作用高度显著（F(1,32)=15.58，p=0.0004；置换检验p=0.001）。在≥7 mm枝条中，栓皮栎的Div/10c显著高于圆叶栎，而较小枝条中未检测到显著物种差异。Bootstrap重采样进一步支持了交互作用的稳定性：在全部10,000次迭代中交互系数保持正值，95% bootstrap区间约为2.02–5.45。然而，不考虑直径梯度的总体Mann-Whitney检验不显著（U=197，p=0.267），证实生物学信号存在于物种×直径交互作用中，而非简单的物种水平差异。

**讨论与结论**

在维管形成层中，形成层环周长随茎干增粗而扩张的需求已获充分确认，主要通过纺锤状原始细胞的垂周分裂实现。木栓形成层面临类似的几何问题——随着下方茎干或枝条周长的增加，其自身周长也必须扩张。栓皮栎中Div/10c随直径增加的依赖性趋势，与木栓形成层以大致类似于维管形成层的方式满足这一需求相吻合；而圆叶栎中缺乏相同趋势则表明，该物种第一个木栓形成层面临的同等需求未被持续满足——这可能是因为它是一个寿命较短、注定被替换的结构，而非持续承受扩张压力的结构。与维管形成层文献的类比增强了这一解释的生物学合理性，同时也强调直接证据——例如对木栓形成层原始细胞本身的时间序列成像——仍有待获取。栓皮栎≥7 mm枝条中更高的木栓层细胞密度，与更活跃的第一个木栓形成层产生更多、更短的径向细胞列相符——这是频繁径向垂周细胞分裂所预期的细胞模式。

转录组学研究已开始表征木栓形成层活性和木栓层分化的分子程序。对栓皮栎、冬青栎及其天然杂交种中软木型与落皮层型树皮的转录组比较，强调了细胞分裂、细胞扩张和木栓质代谢为软木型树皮富集的关键过程，并鉴定出WOX4、AIL5/AIL6、细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶等高表达基因。栓皮栎木栓形成层/木栓层与木质部组织的全基因组RNA-seq比较进一步鉴定了数千个在软木形成过程中特异富集的差异表达基因，其中转录因子和细胞周期调节因子最为突出。这些研究提示，控制分生组织细胞身份和分裂平面定向的独特遗传程序，是本研究所观察到的木栓层差异的一个合理且可检验的候选机制。

综上所述，本研究发现物种特异性的、依赖直径的木栓层组织差异在栓皮栎和圆叶栎的幼枝中已可检测。径向垂周分裂频率的这些对比趋势可能与木栓形成层寿命的差异相关，暗示成熟树皮中落皮层形成与否。研究人员提出，这一差异作为两种物种截然不同的树皮结构的早期解剖学证据，并作为未来年龄序列研究和比较研究的基础——这些研究将直接追踪木栓形成层的命运，从幼枝直至成熟树皮，从而确证本研究所报道的模式是否确实预示了栓皮栎木栓形成层的长期维持和圆叶栎木栓形成层的最终替换。

**研究结论**

本研究表明，在栓皮栎和圆叶栎的幼枝中，一种物种特异性的、依赖于枝条直径的木栓层组织差异已经可被检测到。栓皮栎中径向垂周细胞分裂频率（Div/10c）随直径增加而升高，而圆叶栎中则呈平缓至下降趋势，两物种在直径≥7 mm的枝条中差异最为显著。这些相反的垂周分裂频率趋势可能关联于两种物种不同的木栓形成层寿命——持久维持与最终替换——并暗示成熟树皮中落皮层形成与否。该差异被提出作为两种物种截然不同的树皮结构的早期解剖学证据，为未来年龄序列研究、比较研究以及结合分子谱系分析追踪木栓形成层命运的研究提供了定量基础和可检验的假说。