《EcoHealth》：Longitudinal Survey of Pathogenic Leptospira Species at a Major Park in Sydney, Australia
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自钩端螺旋体病在澳大利亚悉尼重新出现以来，公众对于在城市公园中暴露于致病钩端螺旋体（Leptospira）物种的风险日益关注。本纵向环境调查研究了在一座主要休闲公园中致病钩端螺旋体的时间性检出情况，并探讨了狐蝠（Pteropus spp.）营地的存在是否
自钩端螺旋体病在澳大利亚悉尼重新出现以来，公众对于在城市公园中暴露于致病钩端螺旋体（Leptospira）物种的风险日益关注。本纵向环境调查研究了在一座主要休闲公园中致病钩端螺旋体的时间性检出情况，并探讨了狐蝠（Pteropus spp.）营地的存在是否影响土壤中钩端螺旋体的检出。2024年2月至10月，研究人员从悉尼百年纪念公园（Centennial Park）采集了环境样本和排遗粪便样本（狐蝠粪便，以及作为对照的鹅粪便）。所有样本均采用基于16S rRNA基因的TaqMan定量PCR（qPCR）检测方法进行测试，并生成每月最低循环阈值（Ct）的时间序列以评估交叉相关性。在为期九个月的研究期间，土壤和水样中持续检出致病钩端螺旋体。尽管鹅并非已知的钩端螺旋体储存宿主，但三份排遗鹅粪便样本的qPCR检测呈阳性（Ct 38.22–38.84）。来自狐蝠营地和另一邻近地点的土壤qPCR检测结果之间无差异。水体Ct时间序列与月降水量无相关性，但与一个月前在狐蝠营地采集的土壤Ct时间序列呈正交叉相关。总体而言，研究结果表明该公园存在致病钩端螺旋体的时间性广泛分布。研究人员未发现狐蝠对公园环境钩端螺旋体负荷有直接贡献的证据，但钩端螺旋体在土壤和水体之间的机械运动以及鸟类作为机械载体的作用需要进一步研究。
**论文解读**
**研究背景与存在的主要问题**
钩端螺旋体病（leptospirosis）是一种影响大多数哺乳动物物种的人兽共患细菌性疾病，在包括人类和犬在内的偶然宿主中可导致严重的临床结局。偶然宿主可通过受污染环境中暴露的黏膜和皮肤间接获得感染。属于P1和P2亚支（传统上称为致病性和中间型钩端螺旋体）的钩端螺旋体物种随尿液排出，并因其在土壤和水中的长期存活、潜在增殖和持久毒力而为人所知。历史上，人类和犬的钩端螺旋体病暴发通常紧随极端水文事件之后，推测雨水及次生洪水促进了钩端螺旋体从土壤向邻近水体的扩散。
与全球钩端螺旋体病患者人口统计学从农村农业人群向城市人群转变的趋势相吻合，悉尼城区在数十年无病例后重新出现了本地获得性犬和人钩端螺旋体病病例。犬病例集中在悉尼大都会区内城区，且与社会经济劣势和降雨无特别关联。不断增加的病例数最终引发了人们对犬（和人类）在城市绿地（如保护区和休闲公园）中暴露于致病钩端螺旋体的潜在风险的质疑。
钩端螺旋体病作为一种水文驱动的人兽共患病，其传播是复杂且多向的。野生动物、家养动物和人类频繁光顾的城市绿地可能为动物介导或环境介导的病原体暴露创造了理想场所。这样的生态系统需要采用"同一健康"（One Health）方法来理解疾病传播并制定控制策略。2022年，一例散发性城市人类钩端螺旋体病病例（无旅行史，也未暴露于常见动物储存宿主如啮齿动物或家畜）引发了对其工作场所（当地一家高尔夫球场）存在钩端螺旋体传播的怀疑。随后对环境水样的检测广泛检出了致病钩端螺旋体。此前对悉尼20个休闲公园的环境调查进一步证实了城市公园中P1和P2钩端螺旋体构成的环境风险，PCR检出率很高，并在环境样本中检出了问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）和博氏钩端螺旋体（L. borgpetersonii）。鉴于这些城市公园中致病钩端螺旋体的空间性广泛分布受到怀疑，研究人员提出了以下问题：城市公园中致病钩端螺旋体的存在是否在纵向上具有一致性？哪些野生动物储存宿主可能导致了环境负荷？
**研究目的与重要意义**
就澳大利亚城市中常见的钩端螺旋体野生动物储存宿主而言，已有文献记载大鼠和狐蝠存在尿液排菌。在本研究中，研究人员重点探讨了继发于狐蝠排尿的潜在环境污染。这一决定是基于研究人员此前在百年纪念公园狐蝠营地采集的两份排遗狐蝠粪便样本中偶然检出致病钩端螺旋体（Ct值分别为31.87和38.0），而粪便排菌并非钩端螺旋体公认的传播途径。研究人员假设所采集的粪便样本被尿液或表层土壤机械污染。因此，百年纪念公园被选为本次研究的地点。这座位于悉尼中心的大型历史公园代表了城市生态系统的复杂性，其中野生动物、家养动物和人类共享环境，彼此的健康息息相关。理解人类-野生动物-家养动物-环境的交互界面对评估钩端螺旋体风险和制定适当的风险缓解策略至关重要。
本纵向研究探讨了澳大利亚悉尼百年纪念公园中致病钩端螺旋体的时间性存在。研究目标包括：（1）描述2024年2月至10月期间百年纪念公园土壤和水中致病钩端螺旋体的月度检出情况；（2）评估栖息狐蝠的存在是否影响土壤qPCR检测结果；（3）检验两种样本类型（土壤和水）的qPCR结果之间及其与月降水量之间的交叉相关性。
**主要关键技术方法**
本研究采用纵向生态学设计，于2024年2月16日至10月18日进行了为期九个月的样本采集。研究地点为悉尼百年纪念公园，采样区域包括南部的狐蝠营地（约10,000–15,999只灰头狐蝠和少于5,000只黑狐蝠栖息于此）和位于鸭塘（Duck Pond）对侧开阔草地的鹅栖息地（GH）。每月从狐蝠营地和鹅栖息地各采集三份土壤样本，从鸭塘三个固定位置采集三份表层水样，同时每月从两个地点各采集三份排遗新鲜粪便样本（狐蝠粪便和鹅粪便）。共计五种样本类型，每月15份，九个月共135份样本。DNA提取分别使用针对不同样本类型的商业化试剂盒（水样用DNeasy Blood and Tissue Kit、土壤用DNeasy PowerSoil Kit、粪便用DNeasy Stool Kit）。所有样本均采用已发表的靶向钩端螺旋体rrs基因87碱基对序列的诊断性TaqMan qPCR方法进行一次性检测，阳性截断值设为Ct<40，Ct值在40–45之间的不确定结果在统计分析中按阴性处理。Ct值小于35的样本（n=13）提交进行BLAST辅助测序验证。统计分析在R语言环境下进行，采用Fisher精确检验和卡方检验比较样本类型间的qPCR结果差异，以t检验比较阳性土壤样本Ct值的组间差异。通过创建月度最低Ct值时间序列，利用自相关函数和偏自相关函数评估自相关性，采用tseries包的ccf()函数检验时间序列间的交叉相关性，并分析月降水量与环境和土壤Ct时间序列的关联。
**主要研究结果**
*致病钩端螺旋体的月度检出情况*
2024年2月至10月（即从夏末至初春），致病钩端螺旋体在所有样本亚型中持续检出，仅6月份狐蝠营地土壤样本未检出qPCR阳性。狐蝠营地土壤样本超过一半呈qPCR阳性（15/27，55.56%；Ct 32.55–39.97），8份不确定，4份阴性。鹅栖息地土壤样本18份qPCR阳性（18/27，66.67%；Ct 34.36–39.96），1份不确定，8份阴性。27份水样中25份qPCR阳性（92.59%；Ct 32.90–38.93），2份不确定。提交测序的13份阳性样本中，11份（84.6%）确认为P1和P2亚支钩端螺旋体物种。
*狐蝠营地对土壤qPCR检测结果的影响评估*
整个研究期间，阳性土壤样本数量（Fisher精确检验p=0.58；卡方检验p=0.58）或阳性土壤样本Ct值（t检验p=0.26）在狐蝠营地和鹅栖息地之间均无组间差异。然而，水样的qPCR阳性反应频率显著高于合并的土壤样本（Fisher精确检验比值比=7.79，95%置信区间1.65–74.59，p=0.004；卡方检验=7.29，p=0.007）。
*粪便样本qPCR检测结果*
所有狐蝠粪便样本qPCR检测均为阴性。三份鹅粪便样本检出致病钩端螺旋体阳性（3/27，11.11%；Ct 38.22–38.84）。需要指出的是，由于粪便样本从地面采集，不可避免地混入了一些非粪便物质（如草叶、表层土壤）。
*时间序列交叉相关性分析*
月度最低Ct值的自相关函数和偏自相关函数图未显示自相关性。水样月度最低Ct值与一个月前狐蝠营地土壤月度最低Ct值呈显著正相关（p<0.05）。鹅栖息地土壤和水样之间以及两个采样点土壤之间的月度最低Ct值未见显著相关性。
*月降水量与qPCR结果的关联分析*
月降水量（降雨量和降雨天数）与水样月度最低Ct值之间未发现交叉相关性。同样，月降水量与狐蝠营地土壤月度最低Ct值之间也无交叉相关性。
**总结与结论**
本纵向研究揭示了2024年2月至10月期间，悉尼百年纪念公园环境中存在致病钩端螺旋体的持续性分布，且这种分布独立于当地降雨量和降雨频率。研究人员未发现支持当地狐蝠尿液排菌的证据，但发现水体中钩端螺旋体浓度与一个月前邻近土壤中钩端螺旋体浓度之间存在显著正交叉相关性，提示钩端螺旋体可能在狐蝠营地和邻近池塘之间存在机械运动。从监测角度而言，水样中致病钩端螺旋体的检出率高于土壤样本，对水体的定期PCR检测可能是监测环境钩端螺旋体负荷的有用工具。由于缺乏同类研究，百年纪念公园的结果为发达国家城市公园中钩端螺旋体时间性存在模式提供了首个证据，但关于钩端螺旋体浓度的季节性仍需延长监测（≥2年）才能得出可靠结论。
鸟类粪便中钩端螺旋体PCR阳性的检出值得关注，其结果可能源于排遗样本中残留的植物材料或表层土壤，也可能表明鸟类作为机械载体将钩端螺旋体从邻近池塘转移至草地，甚至鸟类本身可能作为潜在储存宿主。此外，其他未测量的动物活动（如地面栖息的大鼠、树栖的帚尾负鼠以及伴侣犬）可能介导了钩端螺旋体向两个采样地点的引入，其中大鼠活动的生态流行病学研究尤为重要，因为此前报道的犬钩端螺旋体病中最主要的血清型哥本哈根型（Copenhageni）正是通常由大鼠维持和排出的血清型。
研究结论指出：该纵向调查揭示了2024年2月至10月悉尼百年纪念公园环境中致病钩端螺旋体的持续存在，且与当地降雨量和频率无关。未发现支持当地狐蝠尿液排菌的证据。研究人员发现了水体中钩端螺旋体浓度与一个月前邻近土壤中钩端螺旋体浓度之间存在显著正交叉相关性。该特定公园中钩端螺旋体的循环机制仍不清楚，其他储存宿主（如大鼠、负鼠和犬）的作用需要进一步研究。尽管如此，当前结果表明在悉尼这座主要城市公园中存在致病钩端螺旋体的时间性广泛分布。
