《Frontiers in Natural Products》：Protective effects of an aqueous extract from Pinctada fucata martensii mucus on ultraviolet A-induced skin photoaging: in vitro and in vivo evidence
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紫外A（UVA）辐射是皮肤光老化的主要外源性驱动因素，然而有效的海洋来源光保护对策仍未得到充分探索。阿古屋珍珠贝（马氏珠母贝，Pinctada martensii）黏液是一种 largely 未开发的海洋水溶性天然产物来源。在本研究中，通过直接水提和3 kDa
紫外A（UVA）辐射是皮肤光老化的主要外源性驱动因素，然而有效的海洋来源光保护对策仍未得到充分探索。阿古屋珍珠贝（马氏珠母贝，Pinctada martensii）黏液是一种 largely 未开发的海洋水溶性天然产物来源。在本研究中，通过直接水提和3 kDa超滤（不经酶解）制备了一种低分子量水溶性组分（命名为AKN），保留了原有成分谱。研究人员采用正交非靶向液相色谱-质谱联用（LC–MS）和靶向成分分析对AKN进行了系统表征，其中牛磺酸和甜菜碱分别占干重的8.0%和4.1%。其生物学效应在UVA照射的L929小鼠成纤维细胞、脂多糖（LPS）刺激的BV2小鼠小胶质细胞以及UVA诱导的BALB/c小鼠皮肤光老化模型中进行了评价，并以麦角硫因（EGT）作为阳性对照。在细胞实验中，AKN显著抑制关键衰老调节因子（p16、p21、p53）的表达，减弱促炎介质（Tnf、Il6、Il1b），并降低细胞内活性氧。在小鼠皮肤中，局部应用AKN恢复了Col1a1转录，并通过抑制表皮增生和胶原耗竭改善组织学结构，其中4 mg/mL AKN与4 mg/mL麦角硫因提供了显著的保护作用。总体而言，这些发现确立了马氏珠母贝黏液作为天然、非水解型光保护剂的潜在来源，并支持进一步通过生物测定引导鉴定其首要活性成分。
**马氏珠母贝黏液水提物（AKN）抗皮肤光老化作用及机制研究解读**
**一、研究背景与问题**
皮肤老化由内在遗传程序和外源性环境应激共同驱动，其中紫外A（UVA，320–400 nm）因穿透力强、可达真皮层，是皮肤光老化的主要外因。长期UVA暴露导致活性氧（ROS）过量产生，突破内源性抗氧化防御，引发持续氧化应激，进而激活核因子-κB（NF-κB）炎症通路，上调基质金属蛋白酶（MMP-1、MMP-3、MMP-9），加速I/III型胶原降解；同时，持续的氧化损伤引起DNA损伤和细胞周期阻滞，激活p16/p21/p53信号轴，诱导成纤维细胞过早衰老并分泌衰老相关分泌表型（SASP），加剧慢性炎症和组织破坏。传统光防护剂如维A类、抗氧化剂、肽类化妆品虽有一定效果，但存在皮肤刺激、化学不稳定、透皮差或酶解不稳定等问题，亟需开发安全、多靶点的天然替代物。海洋生物富含多种生物活性成分，马氏珠母贝作为南海及日本沿海重要养殖贝类，其加工副产物——黏液，长期被忽视。已有研究多集中于利用酶解软组织制备水解产物，而黏液未经酶解的水溶性天然成分是否具有抗UVA光老化作用，尚不清楚。为此，研究人员直接水提并超滤获得低分子量组分AKN，系统评价其抗光老化功效与机制。
**二、研究目的与主要发现**
该研究旨在探究直接从马氏珠母贝黏液中制备的非水解低分子量水提物AKN能否有效对抗UVA诱导的皮肤光老化，并阐明其细胞和分子机制。结果表明，AKN在细胞水平显著抑制衰老标志物（p16、p21、p53）表达，降低促炎细胞因子（Tnf、Il6、Il1b）和细胞内ROS；在动物模型中，局部涂抹4 mg/mL AKN可显著改善UVA引起的小鼠背部皮肤皱纹、表皮增生和胶原流失，恢复Col1a1转录，效果与阳性对照麦角硫因（EGT）相当。该研究为马氏珠母贝黏液作为天然、非水解抗光老化原料的开发奠定了科学基础。
**三、关键技术方法**
主要技术方法包括：（1）AKN制备：收集马氏珠母贝新鲜黏液，按3:1比例与超纯水混合，4°C匀浆2 h，离心后依次经0.45 μm和0.22 μm滤膜过滤，再用3 kDa超滤膜超滤，收集透过液冻干得AKN，全程未使用酶解。（2）成分分析：采用中国国家标准方法定量牛磺酸，雷氏盐沉淀法测甜菜碱，柱前衍生化高效液相色谱（HPLC）测总氨基酸组成，离子色谱分析单糖和无机离子；同时采用反相C18和亲水相互作用液相色谱（HILIC）两种模式进行非靶向LC–MS profiling，结合mzCloud和ChemSpider数据库进行分子注释。（3）体外实验：使用UVA照射（10 J/cm2）的L929小鼠成纤维细胞构建衰老模型，用脂多糖（LPS）刺激的BV2小鼠小胶质细胞评价抗炎活性，以400 μg/mL AKN预处理或共处理，检测衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、RT-qPCR和ROS水平。（4）体内实验：6–7周龄雄性BALB/c小鼠（SPF级）随机分为5组（每组6只）：对照组、UVA模型组、UVA+1 mg/mL AKN组、UVA+4 mg/mL AKN组、UVA+4 mg/mL EGT阳性对照组。每只小鼠每次UVA照射（365 nm，400 mJ/cm2）前30分钟背部涂抹200 μL相应溶液，连续16天，结束后取背部皮肤进行组织学（H&E、Masson三色染色）、RT-qPCR和Western blot分析。
**四、研究结果**
**3.1 AKN的制备与成分表征**
通过直接水提、离心、3 kDa超滤和冻干获得AKN。定量成分分析显示，冻干AKN含牛磺酸8.0%（w/w）、甜菜碱4.1%（w/w）、水解后总氨基酸6.0%（w/w）、无机成分72.0%（w/w）、总糖0.15%（w/w）。酸水解后氨基酸谱显示甘氨酸含量最高，其次为谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸和缬氨酸。无机离子以氯离子和钠离子为主，还有硫酸根、碳酸氢根、钾和镁。单糖分析表明碳水化合物部分主要由半乳糖和葡萄糖组成。非靶向LC–MS中，牛磺酸和甜菜碱在两种色谱条件下均被注释为显著特征峰，次黄嘌呤仅在HILIC条件下被注释。
**3.2 AKN在体外具有抗衰老、抗炎和抗氧化活性**
MTT实验显示AKN（7.81–1000 μg/mL）对L929细胞无细胞毒性。在UVA照射的L929细胞中，AKN预处理显著降低p16、p21、p53的mRNA表达。在LPS刺激的BV2细胞中，AKN显著降低TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达，并减少细胞内ROS水平。
**3.3 AKN减轻L929细胞中UVA诱导的衰老**
SA-β-Gal染色显示，UVA照射后L929细胞出现典型衰老形态，SA-β-Gal阳性细胞比例显著升高；AKN（400 μg/mL）处理后阳性细胞比例明显降低，细胞形态基本恢复正常。
**3.4 AKN在小鼠中改善UVA诱导的皮肤光老化**
肉眼观察显示，UVA模型组小鼠背部皮肤出现明显皱纹、粗糙、无光泽和弹性丧失。1 mg/mL AKN组皮肤更平滑、皱纹变浅；4 mg/mL AKN组皮肤外观接近正常对照组，与EGT阳性对照效果相当。
**3.5 AKN恢复UVA照射小鼠皮肤中的基因表达**
RT-qPCR结果显示，UVA照射显著上调p16、p21、p53、Mmp9和iNOS，下调Col1a1。1 mg/mL AKN显著降低p16、p21、p53和iNOS水平；4 mg/mL AKN进一步抑制Mmp9并增加Col1a1表达。
**3.6 AKN改善小鼠皮肤组织学和胶原沉积**
H&E染色显示UVA模型组表皮显著增厚，真皮结构紊乱；Masson三色染色显示胶原纤维密度显著降低。1 mg/mL AKN部分减少表皮厚度并轻度恢复胶原；4 mg/mL AKN显著降低表皮厚度、改善真皮结构、大量恢复胶原沉积。定量分析证实了这些组织学观察。
**3.7 AKN调节小鼠皮肤中的蛋白表达**
Western blot结果显示，UVA模型组iNOS、磷酸化p65（p-P65）和p16蛋白水平显著升高。1 mg/mL AKN轻度降低上述蛋白水平，4 mg/mL AKN显著降低所有三个标志物的表达，与RT-qPCR结果一致。
**五、讨论总结与结论**
讨论部分指出，以往对马氏珠母贝生物活性的研究集中于酶解软组织水解产物，而AKN采用直接水提和超滤，不经过酶解，保留了天然游离氨基酸、小肽、核苷和极性代谢物组成，且本研究聚焦UVA（穿透至真皮层）而非紫外线B（UVB）。AKN的保护作用涉及同时调控衰老调节因子（p16、p21、p53）、炎症介质（iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β）和细胞外基质重塑基因（Mmp9、Col1a1），并抑制ROS，有效阻断光老化中氧化应激-炎症-衰老的自我强化级联。值得注意的是，阳性对照EGT虽显著抑制衰老和炎症标志物，但对Mmp9和Col1a1的调控未达统计学显著性，而4 mg/mL AKN展现出独特的转录应答，提示天然多组分复合物可能优于单一抗氧化剂。AKN的效能并非其已鉴定成分（牛磺酸、甜菜碱、游离氨基酸）的简单加和，未表征的微量组分可能协同发挥"随行效应"。此外，AKN的制备工艺简单、绿色，不含有机溶剂和酶解步骤，有利于工业转化。局限性包括：尚未确定单一活性成分及协同机制；未追踪AKN成分的细胞摄取和分布；缺少慢性低剂量UVA或UVA/UVB联合暴露下的组学分析；需进一步进行安全评价和临床试验。
**研究结论**：通过直接水提和3 kDa超滤（不经酶解）从马氏珠母贝黏液中获得的低分子量水溶性组分AKN，在细胞和小鼠模型中可减轻UVA相关的细胞衰老、炎症反应、氧化应激、表皮增生和胶原丢失。这些效应伴随衰老、炎症和细胞外基质相关标志物的改变，胶原沉积恢复，皮肤组织学改善。4 mg/mL AKN在减轻衰老和炎症标志物方面显示出与阳性对照EGT相当的保护功效。该研究凸显了马氏珠母贝黏液作为天然非水解抗光老化成分的利用价值，为未来通过生物测定引导分离其首要活性成分奠定了基础。
