帕金森病与脊髓小脑性共济失调3型中微外显子相关剪接连接使用情况的评估

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Assessment of microexon-associated junction usage in Parkinson’s disease and spinocerebellar Ataxia type 3

　　

摘要
背景：微外显子（microexon）是长度为3–30个核苷酸的短外显子序列，经历选择性剪接（alternative splicing），并已被证实参与多种神经发育障碍的病理过程。然而，其在神经退行性疾病中的作用仍缺乏充分表征。方法：研究人员利用人脑死后组织的深度RNA测序（RNA-Sequencing）及对应的SH-SY5Y细胞模型，分析了帕金森病（Parkinson's disease, PD）患者额叶皮层及脊髓小脑性共济失调3型（Spinocerebellar Ataxia Type 3, SCA3）患者小脑中的微外显子相关剪接连接使用情况。基于STAR比对产生的剪接连接读数对微外显子相关剪接连接使用进行定量，随后采用错误发现率（false discovery rate, FDR）校正进行多重检验的统计学检验，并使用Sashimi图进行可视化。对细胞数据集中选定的候选事件通过聚合酶链反应（PCR）进行评估。结果：在所有数据集中，共鉴定出19个微外显子相关剪接连接候选事件，但均未通过FDR校正。与细胞模型相比，人脑组织中可检测到的微外显子数量显著更多，这可能反映了分化组织与神经母细胞瘤衍生细胞之间剪接复杂性的差异。尽管目视检查提示效应量总体较小且在不同样本间存在变异，但大多数含微外显子的基因在两个系统中均有表达。PCR确认了所选微外显子的可检测性，但未验证实验组之间微外显子相关剪接连接使用的差异。结论：研究结果提供了PD和SCA3中微外显子景观的概览及探索性统计分析。尽管未观察到大规模且一致的疾病特异性微外显子相关剪接连接使用模式，但研究结果提示，神经退行性变中的微外显子调控可能涉及细微且依赖上下文的改变，有待在更大队列中进一步探究。

微外显子相关剪接连接在帕金森病与脊髓小脑性共济失调3型中的研究解读

**一、研究背景与科学问题**

选择性剪接（alternative splicing）是人类基因组中重要的转录后调控机制，能够从单个基因产生多种mRNA异构体，在疾病发生发展中发挥关键作用。微外显子（microexon）是一类长度仅为3–30个核苷酸的短外显子序列，其长度极短，在剪接过程中面临特殊的识别困难，导致外显子跳跃（exon skipping）的发生频率显著升高。微外显子最初于1985年在果蝇（*Drosophila melanogaster*）的UBX基因中被鉴定，此后大量微外显子陆续得到表征。微外显子在神经元组织中高度富集，含有微外显子的基因在突触功能和神经元发育相关通路中显著富集，表明其在神经系统中发挥核心作用。mRNA转录本中微外显子的包含或跳跃对蛋白质功能具有实质性影响，进而影响神经元连接和信号通路。近年研究已将异常的微外显子剪接与多种神经系统疾病相关联，包括自闭症谱系障碍（autism spectrum disorders, ASD）、精神分裂症和癫痫。然而，微外显子剪接异常是否同样参与神经退行性疾病的病理过程，此前尚未得到充分探索。

越来越多的证据表明，RNA代谢紊乱和选择性剪接异常参与多种神经退行性疾病的发病机制。在帕金森病（Parkinson's disease, PD）中，已报道SNCA基因的选择性剪接改变及疾病相关的剪接特征，提示剪接失调对该病发病机制的贡献。在脊髓小脑性共济失调3型（Spinocerebellar Ataxia Type 3, SCA3）中，ATXN3基因的选择性剪接与疾病发病机制相关，且ATXN3转录本多样性在小脑组织中尤为重要。鉴于微外显子独特的剪接需求，PD和SCA3中已报道的选择性剪接改变提示，微外显子相关剪接连接使用在这两种神经退行性疾病中可能同样发生改变。基于这一科学假设，本研究旨在系统评估PD和SCA3中微外显子相关剪接连接的使用情况。

**二、研究设计与主要结论**

研究人员分析了PD患者死后额叶皮层组织（6例患者与6例对照）和SCA3患者小脑组织（6例患者与6例对照）的公开RNA测序（RNA-Seq）数据，同时构建了对应的SH-SY5Y细胞模型：PD模型采用突触核蛋白构建体（包括易聚集的SynT构建体和GFP构建体）转染细胞，SCA3模型采用含有15或148个CAG重复的pEGFP-ATXN3质粒或pcDNA3.1 ataxin-3-myc构建体转染细胞，各设四个独立生物学重复。研究发现，在所有数据集中共鉴定出19个微外显子相关剪接连接候选事件，但均未通过错误发现率（false discovery rate, FDR）校正。人脑组织中可检测到的微外显子数量（PD：444个；SCA3：1,520个）显著多于SH-SY5Y细胞模型（PD：361个；SCA3：433个），这一差异可能反映了分化组织与神经母细胞瘤衍生细胞之间剪接复杂性的不同。表达分析显示，人类微外显子所含基因的绝大多数（>92%）在相应细胞模型中表达水平高于1 counts per million (CPM)，仅约4–7%的基因未被检测到。通路分析揭示，人脑与细胞模型共有的基因涉及膜运输、囊泡运输、细胞维持和细胞内运输等生物学过程，而仅在人类数据集中检出的基因则与突触前过程和钙通道活性等相关。

**三、关键技术方法**

本研究主要采用了以下关键技术方法：基于STAR（v2.7.11b）将RNA-Seq读数比对至GRCh38参考基因组；筛选长度为3–30核苷酸的外显子，设定至少5个读数覆盖50%样本及至少5个剪接连接读数覆盖最少4个样本的过滤标准；通过自定义Python脚本（v3.12.5）合并原始外显子计数与剪接连接读数数据（DOI:10.5281/zenodo.22179987），并计算剪接连接使用比率（junction usage），定义为剪接连接跨越读数与对应基因总表达量之比（U_g,s = J_g,s/C_g）；使用Mann–Whitney-U检验计算p值，采用Benjamini–Hochberg方法进行FDR校正；利用火山图（volcano plot）鉴定候选事件；使用Integrative Genomics Viewer（IGV）生成Sashimi图进行可视化；通过逆转录PCR（RT-PCR）和定量PCR（qPCR）对细胞数据集中的选定候选事件进行验证；使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行功能通路分析；利用g:Profiler进行基因本体分子功能（Gene Ontology Molecular Function, GO:MF）和Reactome通路富集分析。样本队列来源包括已发表研究的PD和SCA3人脑死后组织数据集，以及本研究构建的SH-SY5Y细胞模型数据集。

**四、研究结果**

**PD人类数据集结果**：在PD患者额叶皮层中，444个微外显子通过过滤标准。7个微外显子相关剪接连接事件显示名义上增加的连接使用（ANKRD6、CHPT1、TMEM120A、TMEM144、TOP3A，以及BLOC1S6中对应同一微外显子的两个独立连接），2个事件显示名义上减少的连接使用（EGFL7和TENM4）。

**SCA3人类数据集结果**：在SCA3患者小脑中，1,520个微外显子得到分析，提示3个微外显子相关剪接连接候选事件：2个显示潜在增加的连接使用（ACTN1和NDUFAF5），1个显示潜在减少的连接使用（AQP7）。

**PD细胞模型结果**：361个微外显子得到分析，鉴定出5个候选微外显子相关剪接连接事件，其中2个提示增加的连接使用（HSD11B1L和WDR62），3个提示减少的连接使用（HP1BP3、MRPL33和PABPC1L）。

**SCA3细胞模型结果**：433个微外显子得到评估，鉴定出2个名义上增加连接使用的候选事件（CACNB4和DPH5-DT）。

尽管统计分析鉴定出潜在的候选事件，但IGV Sashimi图可视化未一致显示疾病组与对照组之间微外显子相关剪接连接使用的清晰差异，读数覆盖在各样本间变化较大，目视可见的差异并未统一对应疾病状态。PCR验证方面，研究人员从PD模型（MEF2C、MRPL33、SORBS1）和SCA3模型（APBB1、PHB2、MEF2A）中选择了6个基因进行验证，其中4个基因（MEF2C、MRPL33、MEF2A、PHB2）成功扩增出含有和跳跃微外显子的两种异构体，但qPCR未确认实验组间微外显子相关剪接连接使用的显著差异。

**表达分析与通路分析结果**：在PD数据集中，444个过滤微外显子对应308个独特基因，其中285个基因（92.53%）在细胞模型中表达>1 CPM，2个基因（0.65%）低表达，21个基因（6.82%）未检出。在SCA3数据集中，1,520个过滤微外显子对应557个独特基因，其中532个基因（95.51%）表达>1 CPM，无低表达基因，25个基因（4.49%）未检出。通路分析显示，人脑与细胞共有的PD相关基因（如ANK2、AP2M1）涉及膜运输和囊泡运输，而SCA3共有基因（如PRKAG2、DYNC1H1）与细胞维持和细胞内运输相关；仅在人类SCA3数据集中检出的基因（如CACNA1A、CACNA1E）与突触前过程和钙通道活性相关。

**五、讨论与结论**

本研究发现PD和SCA3数据集中存在若干名义上显著的微外显子相关剪接连接事件，但均未通过FDR校正，表明观察到的差异应被视为初步的、产生假设的结果而非验证性结论。人脑组织与细胞模型之间微外显子检出数量的差异可能反映了分化组织与肿瘤来源细胞系在剪接程序上的差异。SH-SY5Y细胞虽广泛用于神经生物学研究，但保留其肿瘤来源特征，仅代表部分分化的神经元模型，可能无法完全重现成熟神经元剪接程序。在共享基因中，多个基因与先前报道的神经退行性变相关机制一致：PD数据集中BLOC1S6在PD患者中上调、TENM4变异为潜在风险因素、HSD11B1L为PD候选基因、PABPC1L与神经退行性表型相关；SCA3数据集中NDUFAF5与线粒体功能障碍相关神经疾病有关，AQP7、ACTN1、DPH5和CACNB4分别与细胞应激反应、细胞骨架组织、白喉酰胺生物合成和神经元钙信号传导相关。但需强调的是，这些基因中特定微外显子相关剪接连接事件的功能相关性仍属未知，目前缺乏将这些特定事件直接联系至PD或SCA3发病机制的证据。

研究局限性包括：人脑死后组织在年龄、性别、RNA完整性、死后间隔、批次效应、疾病相关神经元丢失、胶质增生及细胞类型组成方面的变异可能影响观察到的连接使用；部分观察差异可能反映组织组成变化而非疾病特异性微外显子调控改变。研究采用靶向分析方法而非全基因组剪接检测工具（如FRASER），因为微外显子长度短且连接覆盖度低，在全基因组方法中检测敏感性受限，且小样本量也会降低全基因组方法的统计稳健性。

研究结论：研究结果提供了PD和SCA3中人脑死后组织及对应SH-SY5Y细胞模型微外显子景观的描述性表征。尽管选定事件经PCR进一步评估，但所检测微外显子相关剪接连接事件的生物学意义尚待确定。鉴于缺乏FDR显著事件、SH-SY5Y模型的探索性本质以及死后组织相关的局限性，当前发现应被视为产生假设的。未来研究需纳入更大队列、更深测序覆盖度、细胞类型感知分析、候选微外显子的功能表征以及更接近生理状态的神经元模型，以确定微外显子失调是否参与神经退行性疾病机制。