利用区室化培养体系实现人iPS细胞来源运动神经元与骨骼肌细胞间神经肌肉接头的可定量形成

《Frontiers in Neural Circuits》：Neuromuscular junction formation by compartmentalized culture using human iPS cell-derived motor neurons and skeletal muscle cells

　　

神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）是连接运动神经元（motor neuron, MN）神经末梢与骨骼肌纤维的突触。NMJ形成的机制主要通过动物模型研究得以阐明。然而，阐明人类神经肌肉疾病的病理生理机制及鉴定潜在治疗药物需要建立人类NMJ模型。在本研究中，研究人员利用人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem, iPS）来源的细胞，通过区室化培养系统建立了人类NMJ模型，该模型能够实现NMJ形成的定量和可重复性评估。在延长NMJ培养过程中，观察到NMJ的形态学变化，以及NMJ和骨骼肌发育相关基因表达的改变，提示NMJ逐步成熟。通过荧光活细胞成像也证实了所形成NMJ的功能性。这些发现表明，该人类NMJ培养模型可应用于研究人类神经肌肉疾病的病理机制及探索治疗药物。

**基于人iPS细胞来源运动神经元与骨骼肌细胞区室化共培养的神经肌肉接头模型研究**

**一、研究背景**

神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）是运动神经元（motor neuron, MN）轴突末梢与骨骼肌细胞（skeletal muscle cell, SMC）之间形成的化学突触，是神经系统中研究最为深入的突触之一，为理解突触发生、发育中神经环路形成以及突触成熟与维持的规律提供了重要模型。成熟NMJ具有特征性形态：MN轴突末梢与SMC膜凹陷表面跨越突触间隙相对排列。突触前末梢含有大量充满神经递质乙酰胆碱的突触囊泡，乙酰胆碱响应神经兴奋而释放，与突触后膜上聚集的乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor, AChR）结合，触发突触后信号传导并产生肌细胞动作电位，最终通过横管系统Ca²⁺通道开放和肌质网Ca²⁺释放诱导肌肉收缩。

NMJ形成的分子机制涉及肌肉预 patterning 过程——AChR与突触后样结构在肌纤维中心附近自发形成，该过程由MuSK–LRP4–Dok-7–rapsyn复合物组装驱动。随后，突触前末梢产生并分泌agrin（集聚蛋白），作为NMJ的主组织者，通过上述受体复合物诱导突触后NMJ结构（包括AChR簇）的组装和稳定，同时促使非突触AChR消散。随着NMJ成熟，AChR簇呈现日益分支的形态，形成特征性"椒盐卷饼样"结构；在分子层面，含有γ亚基的胚胎型AChR（组成α₂βγδ）逐渐被含ε亚基的成体型AChR（α₂βδε）取代，伴随肌管分化及肌球蛋白重链亚基转变。编码NMJ形成和信号转导相关分子的基因突变是导致人类先天性肌无力综合征（congenital myasthenic syndrome, CMS）的最常见病理原因之一，而NMJ随衰老退化也是老年肌萎缩和运动综合征的促进因素。

长期以来，NMJ形成机制研究主要依赖啮齿类、鸡、斑马鱼和果蝇等动物模型。然而，近年研究报道人类NMJ在形态上与啮齿类存在显著差异：人类NMJ倾向于呈现更碎片化或斑块状的形态，且AChR簇面积随年龄增长而增大，提示人类突触成熟过程可能与啮齿类不同。因此，为阐明人类NMJ形成和成熟机制以及CMS等NMJ功能障碍性疾病的发病机制，亟需开发使用人源细胞的NMJ形成实验体系。尽管自2015年以来已有利用人iPS细胞分化来源MN和SMC共培养建模NMJ的报道，以及基于器官芯片、类器官和组装体的模型，但这些体系通常需数月才能观察到NMJ形成，且分析多限于形态和功能层面，而NMJ形成的定量可重复性——评估疾病模型治疗干预的必要前提——尚未得到充分验证。

**二、研究概述与意义**

在本研究中，研究人员利用人iPS细胞分化来源的MN和SMC，建立了一种新型体外NMJ形成实验模型。该方案通过区室化培养系统，可在培养中实现形态可辨识NMJ结构的定量可重复形成，三次独立实验变异系数仅0.27，表明低变异性。在共培养过程中，随着培养时间延长，观察到NMJ面积增大及AChR亚基表达增加等与NMJ成熟一致的形态学和分子变化。此外，刺激与SMC相连的MN可诱导SMC内Ca²⁺水平升高，证实形态可辨识的NMJ结构具有功能活性。这些发现表明，该人源细胞NMJ形成系统为研究人类NMJ发育及其相关病理状态提供了有用平台，不仅可用于CMS等影响突触形成机制的疾病建模，也可用于运动神经元病等影响NMJ维持的疾病研究及治疗药物筛选。

**三、关键技术方法**

研究人员使用人iPS细胞系454E2，在无饲养层条件下维持培养。MN分化采用改良的神经球形成法，通过逐步更换含不同小分子组合（包括SB431542、Dorsomorphin、CHIR99021、Purmorphamin、视黄酸等）的分化培养基，诱导神经球形成并分化为脊髓运动神经元。SMC分化采用强力霉素诱导的MYOD1表达系统，经电穿孔导入MYOD1表达载体后筛选高表达克隆，实现快速高效骨骼肌分化。区室化培养采用Campenot室系统：在Matrigel包被的培养皿上用Pin Rake制造划痕以引导神经突起延伸，将Campenot室用油脂固定在划痕通道上方形成相互隔离的"狭缝"和"室"区。MN神经球解离后种入狭缝，SMC种入室区，利用油脂对培养基的不渗透性保持各自最优培养条件，而轴突可沿划痕穿过油脂屏障延伸至室区与SMC接触。采用免疫细胞化学（NFM、HB9、ISL、MHC、SF抗体及α-BTX标记AChR）结合共聚焦显微镜鉴定NMJ，RT-qPCR检测基因表达，Fluo 4-AM荧光指示剂结合时间推移成像评估NMJ功能。

**四、研究结果**

**MN和SMC的分化**：MN分化至第32天，62.3±7.8%的神经丝蛋白M（neurofilament M, NFM）阳性细胞共表达ISLET1（ISL），69.5±11.6%共表达HB9，表明高效获得脊髓运动神经元。SMC分化至第11天，88.7±4.3%的细胞核被肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MHC）阳性胞质包围，表明高效骨骼肌分化。

**区室化培养NMJ形成**：共培养体系中，通过共聚焦显微镜观察到α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin, α-BTX）结合位点与NFM及突触素（synaptophysin, SF）免疫染色共定位所标识的NMJ样结构。仅培养SMC而不含MN的对照实验中，SMC上仅见散在α-BTX结合位点，无NFM或SF阳性结构，证实NMJ样结构由MN延伸轴突与SMC接触形成。三次独立重复实验显示，平均每平方毫米MHC阳性SMC面积内形成37个突触末端α-BTX结合位点，变异系数为0.27；MHC阳性SMC总面积变异系数仅为0.052。比较区室化培养（MN和SMC各自最优培养基）与单一MN分化培养基培养条件，后者NMJ样结构数量显著减少，表明区室化培养系统对促进NMJ高效形成至关重要。

**NMJ和肌纤维的成熟**：延长培养至第42天，α-BTX结合位点和NMJ样结构数量逐渐减少，而单个NMJ面积趋于增大，与文献报道的人类NMJ随年龄增大而面积增加的特征一致。RT-qPCR分析显示，骨骼肌侧NMJ相关基因——DOK7、LRP4和MUSK——在第30天表达升高，与α-BTX阳性簇的出现时间一致；AChR亚基α、γ和ε亚基在培养成熟过程中也出现表达诱导。在肌球蛋白重链基因家族中，胚胎型MYH3表达逐渐降低，而成体型MYH1和MYH4表达显著升高。这些结果表明培养体系中的NMJ展现出与生理NMJ成熟一致的形态学和分子特征。

**NMJ功能分析**：将Fluo 4-AM荧光Ca²⁺指示剂加载入SMC，向狭缝中加入KCl刺激MN细胞体，通过时间推移成像监测SMC内荧光变化。结果显示，部分肌细胞呈现瞬时荧光增强，而其他细胞无反应；随后直接向骨骼肌室施加KCl确认所有细胞活性正常。在无神经元对照培养中，向狭缝施加KCl未引起SMC内Ca²⁺水平变化。这些结果表明形态可辨识的NMJ能够将神经兴奋传递至SMC，具有生理功能活性。

**五、讨论与结论**

本研究首次在人类iPSC来源MN和SMC共培养体系中证明了NMJ形成的定量可重复性。区室化培养系统模拟了发育中轴突末梢接触肌管的生理情境，MN和SMC在各自最佳条件下分化后再建立接触对高效NMJ形成至关重要。值得注意的是，与MYOD过表达导致的未成熟骨骼肌表型和7–10天培养限制相比，本共培养体系中受MN支配的SMC可维持长达两个月，提示MN支配本身可驱动骨骼肌成熟，这一发现具有重要意义——通过逐步细胞因子刺激从人干细胞分化骨骼肌细胞需要显著更长的时间。尽管如此，本体系存在若干局限：首先，未包含末端/突触周围施万细胞（Schwann cell），而这类细胞已知在NMJ形成和维持中发挥重要作用；其次，本模型中自发性AChR簇较使用人成肌细胞的模型更少，AChR簇在轴突接触位点趋于增大，这与体内神经末梢将分散AChR组织成簇的经典模式存在差异，提示干细胞来源肌细胞的AChR簇形成和成熟机制可能与体内不同，未来需进一步研究AChR簇形成相关分子机制以确定该体系适合建模的疾病类型。

**研究结论**：本研究利用人iPS细胞来源的MN和SMC在培养中实现了定量可重复的NMJ形成。区室化培养系统模拟了生理发育情境，NMJ展现出与生理成熟一致的形态学和分子变化特征，且形成的NMJ具有功能活性。该人源NMJ培养模型可用于研究人类NMJ发育和相关病理状态，包括先天性肌无力综合征及影响NMJ维持的疾病，并可应用于治疗药物探索。