《Chemical Science》：A resource-efficient structure-based workflow for fragment progression enables parallel hit discovery and validation of functionally diverse modulators of NCS-1 protein–protein interactionsOpen Access
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高效的药物发现工作流应在快速且资源节约的实验周期内，生成直接解决关键转化里程碑的数据，包括靶标结合和结合构象的确认、构效关系（Structure–Activity Relationship，SAR）以及生物学相关性。本文中，研究人员描述了一种数据驱动、自动
高效的药物发现工作流应在快速且资源节约的实验周期内，生成直接解决关键转化里程碑的数据，包括靶标结合和结合构象的确认、构效关系（Structure–Activity Relationship，SAR）以及生物学相关性。本文中，研究人员描述了一种数据驱动、自动化辅助、可定制的片段到苗头化合物（fragment-to-hit）演进框架，该框架利用同步辐射光源的高通量晶体学能力，直接产出经结构验证的苗头化合物系列，为快速SAR探索做好准备。这一近期发展起来的直接到生物学（direct-to-biology）方法将以下环节整合在一起：X射线晶体学片段筛选；算法指导的片段合并与试剂优先级排序；低成本机器人阵列合成及液相色谱-质谱联用（LC-MS）反应产物评估；最后，分别利用光栅耦合干涉测量（Grating-Coupled Interferometry，GCI）和晶体学对粗反应混合物进行正交生物物理评估，以确定结合能力和三维（3D）结合构象。研究人员通过一个单一的DMTA（Design–Make–Test–Analyze，设计-合成-测试-分析）循环，对超过250个结构多样的化合物进行了集中推进，从而在一个具有挑战性的靶标类别上验证了该策略的有效性，实现了对目录外化学空间的快速、资源和成本高效的探索。由此发现了神经元钙传感器1（Neuronal Calcium Sensor 1，NCS-1）的蛋白-蛋白相互作用（Protein–Protein Interaction，PPI）调节剂。NCS-1是中枢神经系统中具有治疗相关性的关键调控因子，含有一个能够容纳多个蛋白配体的大尺寸相互作用口袋。研究人员将片段推进为骨架系列，这些骨架系列能够选择性地结合经过生物学验证的子口袋，并且更重要的是，揭示了别构位点和隐蔽结合位点，这对于实现靶标调节的特异性以及后续的苗头化合物到先导化合物（hit-to-lead）生成至关重要。该方法具有通用性、可工程化和可扩展性，并为如何拓展基于片段的苗头化合物发现的范围提供了原理验证。
**论文解读**
**研究背景与立题依据**
神经元钙传感器1（Neuronal Calcium Sensor 1，NCS-1）是一种在中枢神经系统及其他组织中具有多种功能的钙信号蛋白。NCS-1与多种G蛋白偶联受体（GPCR）相互作用，包括腺苷A
2A受体、大麻素CB
1受体和多巴胺D
2受体，同时还与分子伴侣兼鸟嘌呤交换因子Ric-8A以及激酶GRK2等蛋白发生相互作用。NCS-1通过一个大面积的溶剂暴露疏水裂隙（hydrophobic crevice）与其结合伴侣相互作用，该裂隙是神经元钙传感器（NCS）蛋白家族的共有结构特征。已有研究表明，NCS-1与Ric-8A或D
2受体的PPI小分子调节剂支持了该PPI界面的可成药性及其在神经退行性疾病、精神疾病和神经发育障碍中的治疗价值。然而，由于PPI界面尺寸较大且NCS-1具有多个结合伴侣，亟需系统性探索该PPI的化学空间，以获得经结构验证的化学骨架，使其能够结合裂隙的不同区域，从而实现对单个NCS-1 PPI的选择性调控，避免对整个NCS-1相互作用组的全局性影响。与此同时，同步辐射光源高通量晶体学片段筛选（如Diamond Light Source的XChem设施）的发展为快速定位蛋白结合位点提供了有力工具，但如何高效利用蛋白-片段复合物的结构信息指导基于结构的药物设计，将片段命中化合物转化为具有生物学相关性的衍生物，仍是该领域的持续瓶颈。本研究旨在建立一个数据驱动、自动化辅助、资源高效的片段到骨架演进平台，在单个高价值DMTA循环中完成从片段到苗头化合物系列的转化。
**研究方法概述**
研究人员利用XChem设施对NCS-1蛋白晶体进行了大规模X射线片段筛选，使用DSi-Poised、York 3D、FragLites和MiniFrags四个片段库共计1093个片段。通过PanDDA算法进行命中识别，最终在49个数据集中明确建模了82个片段。基于这些片段命中结果，采用Fragmenstein算法进行片段合并与连接，生成超过25000个合并化合物；利用Syndirella工具对选定的12个骨架化合物进行合成可及性枚举，产生超过5000个衍生物；通过HIPPO多参数采样工具进行化合物下选和优先级排序，在固定预算内最大化起始材料的产出。合成采用CAR（Chemist Assisted Robotics）机器人阵列化学平台进行自动化高通量合成，以酰胺化反应和Schotten–Baumann磺酰胺化反应为主；产物通过LC-MS结合MSCheck自动化分析工具进行检测。结合能力评估采用GCI技术从粗反应混合物中进行高通量正交筛选，以解离速率常数（k
off）作为结合检测指标。三维结合构象通过X射线晶体学直接对粗反应混合物进行浸泡实验来确定。PPI调节活性通过免疫共沉淀（Co-IP）和邻位连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）在HEK细胞中进行验证。
**研究结果**
*晶体学片段筛选高效覆盖NCS-1所有子口袋*
研究人员从1600个晶体液滴中制备了1258个晶体，在I04-1线站进行自动化数据收集。在937个收集的数据集中，540个质量足以解析蛋白-片段复合物结构。通过PanDDA分析和额外的人工建模，最终在49个数据集中明确识别了82个片段结合事件，解析分辨率范围为1.5–2.3 ?，多数集中在1.7–1.9 ?之间。
*片段分布分析揭示NCS-1 PPI疏水裂隙的化学空间*
所有片段命中的叠加显示整个疏水裂隙均可被配体占据。根据片段涉及的氨基酸残基，研究人员鉴定出十个不同的结合位点（Site 1–10），沿裂隙的上部（Site 1–2）、中部（Site 3）和下部（Site 4–10）分布。上部区域共发现20个独特片段，Site 1的片段与W30形成π-π相互作用或疏水范德华接触，部分片段与D37形成氢键；Site 2的片段与Y52、F85和T92相互作用。中部区域共有5个片段（Site 3），均与Y52或T92形成氢键。下部区域结合了42个片段，占总数的显著比例，被细分为Site 4–10。其中，Site 8的片段可置换R148侧链，打开裂隙下部；Site 10仅含一个片段，与连接EF-3和EF-4的动态环相互作用。
*基于结构分析的片段合并生成潜在NCS-1 PPI调节剂*
利用Fragmenstein对82个片段进行合并和连接，生成超过25000个合并化合物，施加500 Da分子量截断后，通过均方根偏差（RMSD）、Tanimoto系数和理论结合自由能变化（ΔΔG
bind）进行筛选。结合NCS-1与Ric-8A、D
2R和CB
1R的PPI界面结构信息（部分来自X射线晶体学数据，部分来自AlphaFold2-Multimer预测模型），研究人员将合并化合物按潜在调节的PPI类型进行分类。最终通过人工视觉检查确定66个优先合并化合物：17个潜在D
2R调节剂、16个Ric-8A抑制剂、16个Ric-8A稳定剂、13个CB
1R调节剂以及4个结合EF-3/EF-4环的配体。其中17个为商业可得化合物，以�2600预算直接从Enamine购买。
*算法方法生成与机器人合成和SAR研究兼容的化合物组合*
Syndirella围绕12个骨架进行化学空间枚举，限定为单步合成，反应类型包括HATU酰胺化、Schotten–Baumann磺酰胺化、Williamson合成、Suzuki反应和Chan–Lam偶联。HIPPO从超过5000个衍生物中下选化合物，最终选定6个骨架系列（D2R-5、D2R-12、CB1R-5、Ric8inhib-1、Ric8inhib-3和Ric8enhan-3），起始材料采购预算�8000，设计生成590个产物、涉及280种起始材料。
*机器人阵列合成与验证高效生成基于片段的新化合物*
CAR在四个批次中尝试了454个反应（占计划的76.9%）。Ric-8A靶向系列（Ric8inhib-1、Ric8inhib-3和Ric8enhan-3）占合成总量的95.3%。MSCheck自动化LC-MS分析检测到15个磺酰胺产物（93.8%匹配率）和237个酰胺产物（54.1%匹配率）。总合成成本约�11000（起始材料�8000+内部合成费用�3053）。
*GCI实现溶液中化合物结合的高通量表征*
在购买的纯化合物中，6个（E6、E10、E12、E14、E16、E17）被检测为NCS-1结合剂（35%），亲和力在约60–140 μM范围。内在色氨酸发射荧光实验交叉验证了GCI结果。在252个粗反应混合物中，15个样品表现出可重复的结合响应，k
off值在1–2 s
?1范围内。其中，酰胺系列的Ric8inhib-1-1111和Ric8inhib-1-827以及磺酰胺系列的Ric8enhan-3-1和Ric8enhan-3-666获得了结构-结合响应对。
*纯化合物和粗反应混合物的晶体学筛选*
从252个LC-MS阳性粗混合物中获得了13个配体结合结构，浸泡时间为8–18小时；纯化合物浸泡获得2个结构（E1和E14）。共获得16个结构，除Ric8inhib-1-1111显示两个配体分子外，其余均为1:1化学计量比。
*衍生物的晶体学结构分析*
Ric8inhib-1系列获得9个结构，共享4-氟苯基-2-甲基-1-磺酰基-3-呋喃酰胺核心。其中6个衍生物采用Position 1构象，酰胺基团与Y52和T92形成关键接触；2个采用Position 2构象；Ric8inhib-1-1111采用Position 3构象，在裂隙中含有两个分子并通过呋喃酰胺环的π-π堆积相互接触。Ric8inhib-1-1287因与Y52和T92形成氢键且具有较大的相互作用足迹而备受关注。Ric8inhib-3系列获得2个结构，共享三环芴-哌啶-苯并噻吩骨架，其中一个为另一个的对映异构体。Ric8inhib-3-125的苯并噻吩硫与Y52形成氢键，显示出更优的相互作用指标。Ric8enhan-3系列获得3个结构，共享磺酰胺-喹啉骨架，所有配体均与Y52形成氢键，其中Ric8enhan-3-666额外与L89形成氢键，蛋白-配体接触面积最大。
*片段命中与衍生物之间的构象分歧分析*
衍生物的结合模式与灵感片段及预测结合模式之间存在显著分歧，预测结合模式的中位RMSD为4.60 ?。16个化合物中有9个与预测模式共享零个相互作用，7个保留了≥1个共享相互作用。Ric8enhan-3系列化合物的RMSD最低，强烈再现了其灵感片段x0125的结合模式；而RMSD最高的化合物（E14、Ric8inhib-3-21、Ric8inhib-3-125）则与灵感片段x0119的替代结合模式更为匹配，提示来源于具有多种结合模式片段的化合物可能解析出不同于最初使用的片段构象。
*工作流产出的化合物具有PPI调节活性和转化意义*
化合物E14在HEK细胞的Co-IP实验中稳定了NCS-1/Ric-8A复合物的相互作用，PLA流式细胞术分析显示E14处理使平均荧光强度较DMSO对照增加35%，证实其在细胞内的PPI稳定特性。此外，Ric8inhib-1-1287、Ric8inhib-3-125和Ric8enhan-3-666等CAR衍生化合物与Y52、T92等关键残基的相互作用模式表明其具有潜在的PPI调节活性。16个结晶衍生物均无PAINS子结构，普遍符合Lipinski规则，但部分化合物触发Brenk警示。血脑屏障（BBB）穿透预测表明仅Ric8inhib-3-21可能穿过BBB。片段Z86416893和Z55290386被确定为未来矢量增长的潜在起点。
**讨论与结论**
本研究建立了一个完全在同步辐射设施运行的数据驱动、自动化辅助、资源高效的片段到骨架演进平台，将高分辨率结构分析、化合物设计、合成优先级排序、粗混合物筛选和正交生物物理验证整合到单一流程中。完整DMTA循环在三个月内完成：第一个月用于片段结构分析、计算设计和化合物优先级排序；第二个月用于采购起始材料；第三个月用于自动化合成、LC-MS/MSCheck验证、衍生物结构解析和生物物理验证。这一快速、数据丰富、实验自包含的流程降低了从片段鉴定到苗头化合物系列化学假说生成之间的门槛。
应用于NCS-1这一具有挑战性的PPI靶标，该策略生成了具有生物学相关性和化学多样性的骨架，为后续开发奠定了基础。这些骨架区别于先前报道的未推进至临床前阶段之后的PPI调节剂。鉴于NCS蛋白家族内的序列同源性和结构保守性，本研究中鉴定的片段和骨架系列可作为开发针对该家族其他药理学相关成员的调节剂的基础。
研究人员同时指出若干局限性：对于具有显著构象柔性的系统，需使用PanDDA2以正确处理构象变化；片段筛选阶段中片段多种结合模式的存在可能导致衍生物结合构象与预测模式的显著分歧；粗反应混合物中残留试剂可能竞争结合从而低估结合响应；片段浸泡方案不能直接外推至反应提取物浸泡，需重新评估产物转化率以优化浸泡条件；未来需对整个片段演进管线进行迭代优化——包括设计（Fragmenstein）、化合物枚举（Syndirella）、优先级排序（HIPPO）和合成（CAR）各环节——而非孤立地改进单个方法。尽管各组分的优化有限，本工作流已实现了有意义的命中率和效价水平，凸显了该整合方法在同步辐射片段药物发现中的巨大潜力。
