《Digital Discovery》：NEQ2: a cost-efficient non-equilibrium approach for alchemical free-energy calculations in QligFEPOpen Access
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研究人员描述了一种使用Q分子动力学引擎预测相对结合自由能的完全优化的非平衡（NEQ）炼金术工作流程。该工作流程已集成到QligFEP中，命名为NEQ2。NEQ2采用连续λ切换、S形调度和双向功累积，使得用于自由能计算的分子动力学（MD）模拟能够作为多个独立的短
研究人员描述了一种使用Q分子动力学引擎预测相对结合自由能的完全优化的非平衡（NEQ）炼金术工作流程。该工作流程已集成到QligFEP中，命名为NEQ2。NEQ2采用连续λ切换、S形调度和双向功累积，使得用于自由能计算的分子动力学（MD）模拟能够作为多个独立的短轨迹并行运行。研究人员通过预测包含约200个配体的JACS FEP数据集的相对结合自由能（RBFE），并采用十倍重复，评估了NEQ2方法的性能。研究发现NEQ2方法高效（Kendall τ = 0.39，95%置信区间0.31–0.45；平均无符号误差（MUE）= 1.45 kcal mol?1，95%置信区间1.31–1.63 kcal mol?1），其性能与已建立的平衡态QligFEP方法相当（Kendall τ = 0.38，95%置信区间0.31–0.45；MUE = 1.28 kcal mol?1，95%置信区间1.15–1.43 kcal mol?1）。优化后的NEQ2协议与平衡态QligFEP工作流程高度相关（R2 = 0.88，95%置信区间0.84–0.91；均方根误差（RMSE）= 0.64 kcal mol?1，95%置信区间0.56–0.74 kcal mol?1）。重要的是，NEQ2模拟完全独立，与平衡态QligFEP相比，能够以更少的计算投入获得精确的ΔΔG预测。简单的并行化和降低的计算成本意味着NEQ2方法是QligFEP框架中用于预测配体结合能的重要新工具。
**一、研究背景与问题**
药物设计的核心目标是获得能够与生物靶标结合并诱导预期药理效应的强效、安全且可给药的配体。配体与靶标结合的亲和力由结合态与游离态之间的自由能差决定，因此结合自由能的精确预测是计算化学和药物发现领域的核心问题。在早期药物开发阶段，先导化合物优化过程中需要对候选化合物的相对结合自由能（RBFE）进行预测，以优先安排合成与测试工作。炼金术自由能方法凭借其通用性和强大功能成为RBFE预测的主要工具，通过非物理转化路径将配体A转化为配体B，从而计算相对结合亲和力的变化。
目前广泛应用的平衡态炼金术方法存在若干固有局限：达到平衡态所需时间长，且常需要计算开销大的副本交换方法；不同模拟窗口之间相互依赖，必须顺序执行而无法并行化；中间λ态为非物理状态。非平衡（NEQ）方法作为替代途径，仅在物理上有意义的端点（λ = 0和λ = 1）维持系统平衡，通过多条短而独立的切换轨迹驱动λ在正反方向变化，避免了中间λ态的平衡要求，且因轨迹相互独立而易于并行化。然而，NEQ方法在相对结合自由能预测中的应用远少于平衡态方法，且已有NEQ方法的性能和计算特征尚未被充分评估。为此，本研究旨在开发并系统优化一个基于Q分子动力学引擎的NEQ炼金术工作流程NEQ2，将其集成至QligFEP框架，并在JACS FEP基准数据集上全面评估其性能、稳定性、准确性和计算效率。
**二、研究内容与结论**
研究人员在Q引擎的Fortran源代码中实现了完整的NEQ功能，采用连续λ切换、可调陡度的S形调度框架和自动化的非平衡功累积，并使用Bennett接受比（BAR）估计器计算自由能差。通过对部分tyk2数据集进行网格搜索，系统优化了切换时间（tNEQ）、λ调度陡度参数（L）、积分时间步长和平衡时间（tEQ）等关键参数，并在完整tyk2数据集上进一步验证。最终使用L = 8、tNEQ = 100 ps、tEQ = 1000步和2 fs时间步长的协议，在包含约200个配体转化边、覆盖八个蛋白质靶标的JACS FEP数据集上进行十倍重复评估，并与平衡态QligFEP方法的性能进行了直接对照。研究结果表明，NEQ2取得了与平衡态QligFEP相当的预测精度和排序能力，并显著降低了计算成本，且各切换轨迹的独立性赋予其天然的并行化优势。
**三、技术方法概述**
本研究主要采用以下关键技术方法：基于Jarzynski等式和Crooks涨落定理的理论框架，采用双向非平衡功累积方案并使用BAR估计器求解自由能差；在Q引擎中实现自动化的λ(τ)连续切换，引入可调陡度参数L的S形调度函数；使用线性哈密顿混合的双拓扑炼金术方法；采用25 ?球形液滴和SCAAS表面约束模型模拟蛋白质-配体体系；力场采用Amber ff14SB蛋白力场和OpenFF Sage 2.2.1配体力场，AM1-BCC电荷，TIP3P水模型；基准数据来自JACS FEP数据集（包含bace、cdk2、jnk1、mcl1、p38、ptp1b、thrombin和tyk2八个靶标），参数优化使用tyk2数据的8条子集，最终验证使用完整JACS数据集，所有RBFE预测进行10次独立重复，不确定性通过自举法评估。
**四、研究结果**
**1. 部分tyk2数据集上非平衡工作流程的优化**
研究人员建立了包含反复切换轨迹和短平衡间隔的NEQ2工作流程，通过对双时间步长（1或2 fs）、非平衡时间tNEQ和λ陡度L的网格搜索，发现较长的tNEQ（32 ps）与陡峭的S形调度（L = 8）能够使NEQ方法相对于平衡态方法正确排序化合物。进一步通过考察tEQ从50步到1000步的效果，发现tEQ = 1000步（2 ps）的平衡时间足以实现轨迹间的去相关，此时NEQ2取得最佳排序性能。这表明合适的λ调度和充分的平衡去相关是保证NEQ方法可靠性的关键因素。
**2. 陡度参数和tNEQ对功累积的作用**
通过对蛋白结合态ejm31–ejm44转化边的单边研究，揭示了L和tNEQ影响排序能力的机制。将正反方向的累积功曲线进行对比分析后发现：L值过小时，功在模拟端点快速累积，引发不确定性和耗散；L值过大时，功在模拟中段迅速变化，同样导致耗散；而L = 8的S形调度使功几乎线性累积，正向和反向功分布获得大量重叠。同时，增加tNEQ导致正向功（Wf）和反向功（Wr）分布间的重叠增大、分布均值之差减小，说明较长的切换时间使模拟更接近可逆过程，从而降低了不可逆功。这些发现为选择最优参数提供了物理解释。
**3. 全tyk2数据集上的非平衡方法优化**
将32 ps、64 ps和100 ps三种tNEQ方案在包含22条边的完整tyk2数据集上比较，计算成本与平衡态方法匹配。结果显示32 ps方案未能完全复现平衡态方法的性能（Kendall τ = 0.42，R
2 = 0.39），64 ps略有改善，而100 ps方案与平衡态QligFEP性能相当（Kendall τ = 0.47，R
2 = 0.60）。这表明单一边上观察到的长tNEQ改善功分布重叠的效应在完整数据集上同样成立，100 ps方案由此被确定为适用于JACS数据集的通用NEQ2基准协议。
**4. NEQ2方法在完整JACS FEP基准数据集上的表现**
在完整JACS数据集上，NEQ2（L = 8，tNEQ = 100 ps，tEQ = 1000步，2 fs时间步长，10次重复）取得的整体预测精度和排序能力与平衡态QligFEP相当，且与PMX-Sage 2.0和FEP+等外部基准的结果在置信区间内一致。直接比较NEQ2与平衡态QligFEP的ΔΔG预测值显示了接近一一对应的关系，说明非平衡估计器相对于平衡态方法引入的额外误差很小。但部分变换边在正反功分布上重叠不足，导致BAR估计不可靠；这类失败在NEQ2中较平衡态方法更频繁，尤其在cdk2和jnk1等包含较大化学扰动的数据组中，这主要与NEQ2的单次变换模拟时间较短有关。约束违反导致的起始轨迹不稳定事件也导致部分可用轨迹减少，从而增加了统计不确定性。
**5. 计算成本缩减条件下的性能评估**
为量化NEQ2的计算效率，研究人员在保持其他参数不变的前提下，逐步移除切换轨迹子集以降低总计算量，并在不同成本缩减水平下重新评估预测性能。结果显示，在仅保留约40–60%计算成本的条件下，NEQ2在多数靶标上仍保持了大部分预测性能；但成本进一步降低时，失败边数量上升，反映了有效采样不足和功分布重叠不够的问题。对mcl1数据集的分析表明，部分初始偏差较大的变换边随着模拟轨迹增加，预测逐渐收敛。自举法获得的标准误差与预测误差的相关性检验证实，信心区间可以作为判断特定变换边是否需要追加模拟的有效内部指标，这使得计算资源可以在非平衡协议中被灵活而高效地分配。
**五、讨论与结论总结**
讨论部分强调，NEQ2的性能强烈依赖于λ调度陡度参数L和切换时间tNEQ的合理选择：合适的S形调度能够改善功累积曲线形状并减少端点不稳定性；足够的tNEQ能够降低不可逆功，提升正反功分布的重叠，从而产生更可靠的BAR估计。此外，轨迹间充分的去相关至关重要。在优化条件下，NEQ2在tyk2和JACS数据集上均复现了平衡态QligFEP的精度，表明非平衡估计器本身几乎不引入额外误差，进一步改进预测与实验的一致性的主要方向在于能量模型精度和构象采样充分性，而非NEQ估计器的优化。
NEQ2的轨迹独立性使其易于大规模并行化，无需中间λ态的平衡和通信开销。在成本匹配条件下，NEQ2在JACS数据集上较平衡态QligFEP节省约20–40%的计算资源，具体节省幅度取决于转化的复杂性和收敛所需的采样量。这些特性使NEQ2特别适用于以较小局部化学修饰为主的同类系列化合物的快速RBFE筛选，能够在低置信度的边上灵活追加模拟，同时避免已充分收敛转换的冗余计算。未来可通过实现收敛自动检测、引入自优化λ调度、λ交换增强采样等方法进一步拓展NEQ2的适用范围，使其有潜力处理涉及形式电荷变化或化学骨架跳跃的更具挑战性的扰动类型。
研究结论部分指出：本研究建立了NEQ2方法，这是一种在Q引擎中用于预测相对结合自由能的非平衡炼金术工作流程。NEQ2在包含约200个转化、覆盖八个蛋白质系统的完整JACS FEP基准数据集上进行了评估。NEQ2在减少计算投入的同时取得了与平衡态QligFEP相当的精度。由于每条切换轨迹的独立性，NEQ2易于并行化，使其非常适合同类系列的快速RBFE筛选和聚焦的构效关系研究。尽管对于更具挑战性的扰动，平衡态QligFEP协议仍然是更优的选择，但对许多系统而言，NEQ2提供了一种实用、经济高效且可扩展的方法。重要的是，NEQ2与QligFEP框架中已建立的平衡态方法协同工作，拓宽了基于结构的药物发现计算方法的工具库。
