基于1H NMR代谢组学的无抗生素猪肉认证与溯源初步研究

《Journal of the Science of Food and Agriculture》：Metabolomic insights for the authentication and traceability of antibiotic-free pork: a pilot study

　　

肉类供应链中的无抗生素生产已成为备受关注的议题，因为新的自愿性标签声明需要得到认证以防止欺诈。为此，研究人员采用基于非靶向¹H核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）的代谢组学方法，结合非监督（主成分分析，principal component analysis, PCA）与监督（正交偏最小二乘判别分析，orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA）多元分析，对来自四个意大利育肥猪场的猪肾脏（n=47）和膈肌（n=54）样本进行了研究，以考察极性与非极性代谢物水平的变化，并区分经抗生素处理（antibiotic-treated, ABT）与从未暴露于抗生素（antibiotic-free, ABF）的猪。研究结果显示，ABF与ABT猪样本得到了完全区分，尤其是在所研究组织的水提物中。所有在极性提取物中差异积累的判别代谢物均被注释，并依据其分子结构归入不同的生化类别（碳水化合物、氨基酸及其衍生物、有机酸、醇类、胆碱及其衍生物、核苷类），以便讨论与抗生素给药相关的代谢过程的假定生物学功能。在上述各类别中，氨基酸及其衍生物占受抗生素给药影响的代谢物的大部分（60%）。
? 2026 作者。《食品与农业科学杂志》（Journal of the Science of Food and Agriculture）由John Wiley & Sons Ltd代表化学工业学会出版。

**研究背景与存在问题**
肉类供应链中长期存在欺诈行为，例如2013年“马肉门”事件曾引发公众对肉品真实性的担忧。消费者对安全、质量和真实性的关注推动了“无抗生素”（antibiotic-free, ABF）肉制品这一新兴市场。目前，ABF猪肉认证主要依赖自愿性认证计划，这些计划以文件记录为基础，缺乏客观分析手段，因而容易遭受欺诈。欧盟已通过第1831/2003号法规禁止将抗生素作为生长促进剂，并通过第37/2010号法规设定动物源性食品中药理活性物质的最大残留限量。然而，这些法规主要针对靶向检测，只能识别预设分析物，可能漏检未知或意外标志物。因此，需要发展非靶向分析策略以验证ABF标签的真实性。代谢组学作为对营养、环境及抗生素施用等外部变化最敏感的组学技术，能够测量低分子量代谢产物（<1000–2000 Da），为肉类真实性鉴别提供新的突破点。本团队前期对猪肝代谢组的研究已取得积极结果，本研究将该策略扩展至肾脏和肌肉组织，以进一步验证其适用性。

**研究目的与内容**
本研究的目的是利用基于一维¹H NMR的非靶向代谢组学方法，调查抗生素暴露对猪肾脏和膈肌组织代谢指纹图谱的影响，并评估该方法区分ABT与ABF猪样本的能力。研究样本取自意大利北部四个商业化育肥猪场，共103头重型猪，全部用于帕尔马干酪火腿生产链，并按保护指定原产地（Protected Designation of Origin, PDO）帕尔马火腿法规进行饲养。猪只在约270日龄屠宰，肾脏和膈肌在屠宰当日采集。

**主要关键技术方法**
样本队列包括49个肾脏样本（ABFK n=27，ABTK n=22）和54个膈肌样本（ABFM n=35，ABTM n=19），所有猪只均来自商业化农场。采用Bligh-Dyer双相提取法（经微小修改）分别获得极性和非极性提取物。极性提取物溶于含有磷酸盐缓冲液（pH 7.0，100% D₂O）的溶剂中，非极性提取物溶于甲醇-d₄和氯仿-d₄混合物中。使用配备5 mm ROYAL探针、磁场强度为600.17 MHz的JEOL ECZ 600 NMR谱仪采集一维¹H NMR谱。所有谱图经MestReNova软件进行相位和基线校正，并手动积分分箱。随后利用SIMCA软件进行PCA和OPLS-DA，其中PCA采用自动缩放，OPLS-DA采用帕累托缩放。通过变量重要性投影（variable importance in projection, VIP）≥1和单变量检验P<0.05筛选相关信号，并与文献及数据库（如Human Metabolome Database）比对进行代谢物注释。

**肾脏和膈肌的非监督统计分析**
研究人员对每个组织（肾脏和膈肌）和每种提取物（极性和非极性）分别进行PCA。肾脏极性提取物模型在排除1个分析异常值后，提取6个主成分，R2X=0.76，Q2=0.60，得分图显示ABF与ABT之间存在微弱分离趋势，且ABF样本更紧密。肾脏非极性提取物模型（R2X=0.67，Q2=0.35）未显示清晰分组。肌肉极性提取物模型在排除1个异常值后，提取8个主成分，R2X=0.79，Q2=0.58，得分图显示ABF与ABT样本有明显分离趋势。肌肉非极性提取物模型（R2X=0.77，Q2=0.46）未显示明确分组。总体而言，极性提取物模型性能优于非极性提取物，肌肉极性模型拟合度最佳。这一结果表明，抗生素给药引起的代谢改变主要反映于极性代谢物中。

**有监督统计：极性提取物**
考虑到类型归属，仅对极性提取物进行OPLS-DA以建立分类器。膈肌模型质量较高：R2Y=0.96，R2X=0.73，Q2=0.76，得分图中ABF与ABT样本沿预测成分完全分离，ABF位于正侧，ABT位于负侧，但组内存在一定异质性。肾脏模型参数稍低（R2Y=0.73，Q2=0.47），但仍形成两个独立簇，且存在类内离散。这说明极性提取物中的代谢特征能够有效区分处理组与未处理组，且肌肉组织的判别效果优于肾脏。

**肌肉和肾脏极性提取物的共振归属**
在肌肉极性提取物中，研究人员注释了多种差异代谢物，包括碳水化合物（α-葡萄糖、β-葡萄糖、肌醇）、醇（甘油）、胆碱及其衍生物（甘油磷酸胆碱、磷酸胆碱）、有机酸（乙酸盐、β-羟基丁酸）、氨基酸及其衍生物（丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸）、核苷（肌苷）以及脂质类分子（低密度脂蛋白，LDL）。除天冬氨酸下调外，其余所有代谢物在ABT组中均呈上调趋势。在肾脏极性提取物中，注释到肌醇、天冬氨酸、肌酸、脯氨酸和甘油磷酸胆碱，这些代谢物在ABT组中均上调，其中肌酸（FC=1.96）和天冬氨酸（FC=1.40）变化幅度最大。这些代谢物按生化类别归类，氨基酸及其衍生物在所有注释代谢物中占比最高（肌肉中约60%，肾脏中60%），提示氨基酸代谢是抗生素暴露影响的核心通路之一。肌肉中糖异生氨基酸的积累可能与疾病状态下骨骼肌蛋白分解增强及免疫系统激活有关；肾脏中肌酸和天冬氨酸的升高则与感染相关应激反应的报道一致。

**讨论部分总结**
本研究作为概念验证性调查，在真实商业条件下进行，抗生素处理仅是多源变异之一。尽管猪只个体差异、农场管理差异及组织间代谢功能差异（肾脏侧重废物清除与药物代谢，膈肌侧重能量产生）均可能影响代谢组，但通过非靶向NMR代谢组学结合多变量分析，仍能捕获与抗生素给药相关的代谢特征。水相提取物比有机相提取物更敏感，肌肉组织积累的判别代谢物数量多于肾脏，提示肌肉可能更适合用于监测抗生素暴露。这些发现为未来开发客观的ABF肉品认证工具提供了初步依据，但尚需更大规模、更受控的研究来进一步验证和机制化这些结果。

**结论翻译**
本研究证实，基于NMR的非靶向代谢组学是研究抗生素暴露猪代谢差异的潜在有价值工具。双相提取实现了多水平评估，揭示出ABT与ABF膈肌样本的清晰区分。与肾脏相比，肌肉组织积累了更多相关代谢物，可能表明其更适合监测抗生素暴露。水提物比有机提取物更敏感，强化了极性相在检测抗生素治疗中的作用。