《Methods in Ecology and Evolution》：From fluke to fragment: A multifaceted method for molecular sex identification and mitochondrial haplotyping from environmental DNA samples
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环境DNA（eDNA）分析已成为非侵入性生物多样性监测的有力工具，然而群体遗传学方法在环境样本中的应用仍未得到充分探索。即使遗传痕迹来源于单个个体，低靶标DNA浓度以及扩增或测序人工产物也可能影响下游遗传推断。研究人员提出了一种新方法，用于从脊椎动物个体附近采
环境DNA（eDNA）分析已成为非侵入性生物多样性监测的有力工具，然而群体遗传学方法在环境样本中的应用仍未得到充分探索。即使遗传痕迹来源于单个个体，低靶标DNA浓度以及扩增或测序人工产物也可能影响下游遗传推断。研究人员提出了一种新方法，用于从脊椎动物个体附近采集的水体eDNA样本中获取种群统计学信息和谱系水平的线粒体基因组信息，同时评估配对组织采样对基准化eDNA群体遗传分析的效用。
研究人员在亚速尔群岛（Azores）的抹香鲸（*Physeter macrocephalus*）相遇期间收集了配对的eDNA和组织样本。对样本进行了脊椎动物eDNA存在性筛查，并采用一种新型分子性别鉴定检测方法进行分析。此外，使用长距PCR（long-range PCR）扩增多达五个线粒体DNA片段（约3–4千碱基对），随后在牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies, ONT）平台上进行测序。研究人员开发了一种严格的三层级过滤框架，能够识别eDNA样本中真实的线粒体基因组变异，以便在单倍群水平上最大程度地恢复遗传多样性。通过配对组织对eDNA样本进行验证，优化了参数值，以最大化一致性并减少虚假变异检出。
性别鉴定在50%的eDNA样本中获得成功，与配对组织的一致性达到96%，且海洋脊椎动物DNA浓度显著预测了性别鉴定成功。此外，Medaka抛光处理从eDNA样本中生成了高一致性的线粒体共有序列（>16 kb）。在该框架的过滤方案中，由多达453个高置信度线粒体SNP组成的精选SNP组合解析出19个单倍群，eDNA与组织样本之间的一致性达到93%。一种中等程度的生物信息学过滤策略在最大化生物学准确的单倍群恢复同时最小化测序人工产物，提供了最可靠的谱系水平推断。
这种综合方法表明，靶向核基因检测与长距线粒体测序相结合，可以从水体eDNA中恢复个体水平的遗传信息。通过定义决定成功率的分析阈值，并展示配对组织基准化如何为未来应用校准基于eDNA的群体遗传学见解，该框架推进了通过eDNA进行种群的非侵入性遗传监测，并实现了对濒危和遗传脆弱物种的种群水平监测与保护。
**环境DNA群体遗传分析的新框架：分子性别鉴定与线粒体单倍型分型的整合**
环境DNA（eDNA）分析凭借其非侵入性、高灵敏度等优势，已成为生物多样性监测的重要工具。然而，目前绝大多数eDNA研究仍停留在物种检测水平，将其拓展至种群遗传学领域（如估算遗传多样性、亲缘关系、性别比例和基因流）的尝试尚处于起步阶段。这一拓展面临多重挑战：环境样本中靶标DNA浓度极低、片段化严重，且扩增和测序过程中易引入人工产物，导致从环境信号中可靠地恢复个体水平的遗传信息十分困难。以往基于eDNA的线粒体单倍型研究多依赖300–500 bp的短条形码区域，遗传分辨率有限。虽然长读长测序技术（如ONT）的出现使完整线粒体基因组重建成为可能，但此前的研究多局限于受控条件，野外环境下的可行性尚未得到充分验证。此外，核基因标记（尤其是性别连锁位点）在环境DNA中的检测依然极具挑战性，而核DNA又是估算种群结构和繁殖动态不可或缺的信息来源。
针对上述问题，研究人员以抹香鲸（*Physeter macrocephalus*）为模型，探索了一套集分子性别鉴定与线粒体长片段测序于一体的eDNA分析方法。抹香鲸因其深潜习性、广阔的活动范围以及母系社会结构，成为检验eDNA种群遗传学应用的理想物种；同时，其较低的线粒体遗传多样性和可获得的配对组织样本，也为方法验证提供了良好条件。该研究的主要目的是：评估能否从单个个体附近采集的水体eDNA中同时获得核性别标记和线粒体谱系信息，并通过配对组织样本对eDNA来源的遗传推断进行校准和优化。
在方法层面，研究人员于2023年夏季在葡萄牙亚速尔群岛开展了系统采样，共采集59份组织活检和62份eDNA样本，其中48对为直接配对的eDNA/组织样本。eDNA样本为单个抹香鲸尾迹水印处采集的30升水样。实验室工作流程包括：使用MarVer3引物进行脊椎动物eDNA筛查；设计针对SRY和ZFX基因的PCR测定进行分子性别鉴定；利用长距PCR（LR-PCR）扩增线粒体DNA片段（eDNA样本扩增三个重叠片段，组织样本扩增五个），随后在ONT平台上完成测序。生物信息学流程则包括：Guppy软件进行超精度碱基识别，minimap2进行读段比对，Medaka神经网络模型进行共有序列抛光，bcftools进行变异检测，并设计了一套三级质量过滤框架（Tier 1覆盖深度过滤、Tier 2变异质量过滤、Tier 3跨样本生物学一致性过滤），同时设定了严格（strict）、中等（moderate）和宽松（relaxed）三种过滤参数配置，以系统评估不同严苛程度对SNP回收和单倍群推断稳定性的影响。
**主要结果**
**3.1 分子性别鉴定**
通过对59份组织和62份eDNA样本的分析，eDNA样本的性别鉴定成功率为50%，与配对组织的性别判定结果一致性达到96%。进一步使用二项广义线性模型（GLM）分析发现，海洋脊椎动物DNA浓度是性别鉴定成功与否的显著预测因子（β=0.37，p<0.05）：海洋脊椎动物DNA浓度每增加1 ng/μL，eDNA样本性别鉴定成功的几率提高约45%。这一结果表明，靶标DNA的绝对丰度是限制eDNA中核标记回收的主要因素之一，也提示在实际应用中应通过定量筛选优化样本资源分配。
**3.2 测序覆盖与共有序列**
在71个进入测序的样本中（46个组织、25个eDNA），组织样本在线粒体覆盖度和Tier 1保留率上普遍优于eDNA样本，但中等和宽松阈值能够有效提升eDNA样本的保留比例。覆盖广度分析显示，eDNA样本的高深度覆盖区域少于组织样本，覆盖衰减更明显。进一步研究发现，平均线粒体深度比原始读段数更能预测分析成败：低于60×平均深度的eDNA样本全部无法通过后续QC层级，而高于约350×平均深度的eDNA样本则能稳定通过全部过滤步骤，并准确重现配对组织的SNP模式。尽管Medaka抛光能为所有通过Tier 1的eDNA文库生成全长（>16 kb）且BLAST一致性>99%的参考引导共有序列，但这些序列的真实可调用区域通常只有约3 kb，说明共有序列中存在跨低覆盖区的参考骨架插补。因此，后续单倍型分析仅使用有可调用读段支持的过滤后SNP位点，而非依赖全序列。
**3.3 线粒体SNP面板与单倍群分辨率**
变异检测在Tier 2过滤后保留了1344–1449个候选SNP位点；经过Tier 3生物学过滤，最终分别获得146（严格）、288（中等）和453（宽松）个高置信度信息SNP。绝大多数高置信SNP位于COX2–CYTB–控制区，而12S–COX1区域仅有零星分布。在配对样本中，分别有4、7和8对满足高置信匹配标准。单倍群水平的eDNA与组织一致性在三种过滤配置下均较高（严格90%、中等93%、宽松88%），且单倍群结构在不同参数下保持稳定，说明该方法在谱系水平上具有可重复性。中等过滤方案在保留真实生物学变异和去除错误变异之间取得了最佳平衡，为后续分析推荐使用。
**3.4 配对SNP距离与统计验证**
基于配对eDNA/组织样本的SNP分型结果，研究人员计算了遗传距离并进行置换检验（10,000次随机配对）。结果显示，真正配对的eDNA/组织样本间的线粒体SNP差异显著低于随机配对（p<0.05），从统计学上验证了eDNA来源单倍型调用的可靠性。中等过滤策略同时保证了较高的配对一致性和足够的SNP数量，因此被认定为本研究中最稳健的生信参数组合。
**讨论与结论**
讨论部分强调，本研究成功从超过半数脊椎动物阳性的eDNA样本中扩增出>3 kb的长线粒体片段，证明长片段线粒体DNA可在开放海洋环境中存留，并支持了LR-PCR与ONT测序联用在野外eDNA样本中的可行性。采样设计中的多个因素（如紧邻目标个体、大体积过滤、快速保存等）可能促进了长片段的回收。性别鉴定的结果证实了靶标DNA浓度对核标记回收的关键作用，并建议使用物种特异性定量测定作为样本筛选指标。此外，线粒体覆盖广度而非原始读段数是决定下游分析成败的更优指标，应在生信流程中加以考虑。单倍群结构对于不同过滤阈值显示了稳定性，但这种稳健性可能与本研究特定的有利条件（如低线粒体多样性、新鲜样本）有关，因此在更复杂体系内需重新校准。配对组织样本作为基准，有助于评估过滤参数对eDNA遗传推断的敏感性与特异性，并提示在缺乏组织样本时，可借助公共数据库或重复样本进行参数优化。研究最终认为，eDNA长读长测序与非侵入性核标记扩增的结合，能够从环境样本中获得可靠的谱系级与个体级遗传信息，为濒危物种的种群监测和保护遗传学提供了一种强有力的新工具。
