冷等离子体技术在豆类种子中的应用进展：作用机制、营养品质改善、食品安全与可持续农业

《Legume Science》：Advances in Cold-Plasma Technology for Legume Seeds: Mechanisms, Nutritional Quality Improvement, Food Safety and Sustainable Agriculture

　　

冷等离子体（Cold Plasma, CP）是一种富含活性氧和氮物种（Reactive Oxygen and Nitrogen Species, RONS）的非热电离气体，已成为提升豆类产量和品质的可持续技术。本综述总结了CP在豆类中应用的最新进展，重点关注种子萌发、幼苗活力、营养素强化、抗营养因子降低、加工功能特性改良以及微生物去污等方面。经过优化的CP处理可显著改善萌发性能、营养素消化率和生物利用度，同时降低植酸和胰蛋白酶抑制剂等抗营养化合物。CP还能有效灭活细菌和真菌污染物，且不影响种子品质。除上述已确立的应用外，本综述还强调了新兴研究领域，包括通过调节抗氧化防御和逆境响应途径实现CP介导的非生物胁迫引发，以提高耐旱性、耐盐性和耐冷性。研究人员还讨论了关于增强豆类–根瘤菌（Rhizobium）共生关系和生物固氮（Biological Nitrogen Fixation, BNF）的最新证据，重点阐述了结瘤能力和固氮酶活性的改善。此外，研究人员考察了CP诱导的种子微生物组变化，包括抑制病原体和促进有益微生物。研究人员也探讨了等离子体活化水（Plasma-Activated Water, PAW）在生产更安全、营养更丰富且萌发均匀的豆类芽菜方面的潜力。最后，研究人员论述了与处理标准化、安全性评估、工艺放大和监管可接受性相关的挑战。总体而言，CP代表了一种多功能且环境友好的方法，可用于可持续豆类生产和品质提升。

1 引言

豆类是全球粮食和农业的基石，包括鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）、小扁豆（Lens culinaris Medik.）、普通菜豆（Phaseolus vulgaris L.）、大豆（Glycine max L. Merr.）、绿豆（Vigna radiata L.）、豌豆（Pisum sativum L.）、豇豆（Vigna unguiculata L. Walp.）、蚕豆（Vicia faba L.）和瓜尔豆（Cyamopsis tetragonoloba L.）。豆类提供了全球人类膳食蛋白质总量的约20%–25%，在南亚、撒哈拉以南非洲和拉丁美洲的低收入国家，豆类提供的膳食蛋白质比例高达60%–80%。豆类还富含膳食纤维（占干重的20%–35%）、复合碳水化合物、B族维生素、二价矿物质以及多种促进健康的植物化学物质。豆类特有的生物固氮（BNF）能力使其在与土壤根瘤菌（Rhizobium、Bradyrhizobium、Mesorhizobium和Sinorhizobium）共生时，能够在减少或不使用合成氮肥的条件下进行作物生产。然而，豆类消费仍面临诸多障碍，包括抗营养因子（Antinutritional Factors, ANFs）（如植酸、胰蛋白酶抑制剂和凝集素）、较长的烹饪和浸泡时间、微生物污染以及天然豆类粉和蛋白浓缩物有限的加工功能特性。传统的加工策略如长时间浸泡、高压蒸煮、萌发/发酵和脱皮等虽能在一定程度上克服这些障碍，但各有局限。在此背景下，冷等离子体（CP）作为一种非热加工技术在过去十年间引起了广泛科学兴趣。CP产生化学组成多样的RONS混合物，整体气体温度在25°C–60°C之间，远低于大多数种子蛋白和维生素的变性温度。尽管此前已有综述涉及CP在豆类中的应用，但均未将非生物胁迫引发、共生固氮和种子微生物组调控整合到一个以豆类为中心的统一框架内。本综述综合评估了CP对豆类种子品质的三大主要维度以及农业表现，并独特地融合了上述三个新维度。

1.1 综述方案与文献筛选

研究人员采用结构化文献检索和筛选方案。在Scopus、Web of Science、ScienceDirect、PubMed和Google Scholar数据库中检索截至2026年6月的文献。纳入标准包括：研究冷等离子体或密切相关非热等离子体处理，以豆类种子或豆类衍生材料为生物底物，报告至少一项相关结局指标，且提供充分的方法学或实验信息。排除标准包括：与豆类无关、不涉及CP处理、仅关注非食品应用、信息不充分或为非同行评审材料的研究。证据强度根据一致性、直接性、实验完整性和可重复性进行定性判断。

2 冷等离子体技术：原理、源与化学

2.1 非热等离子体的基本物理原理

等离子体是物质的第四态。非热等离子体（或非平衡等离子体）中，整体气体温度接近环境温度（25°C–60°C），但电子在施加电场中被加速至高温（>10,000 K）。这种热力学非平衡状态可在常压下通过交替或脉冲高压输入功率实现。自由电子具有足够动能与气体分子发生非弹性碰撞，产生初级RONS。在空气等离子体中，初级前体为分子氮（N₂）和氧（O₂）。产生的RONS混合物（•OH、•NO、O₂^•?、¹O₂、H₂O₂、O₃、•NO₂、ONOO^?）是CP处理的主要生物效应因子。

2.2 豆类种子处理的等离子体产生系统

2.2.1 介质阻挡放电（DBD）

DBD是豆类种子研究中报道最广泛的等离子体产生系统。种子置于平行或圆柱形电极之间，其中一个电极覆盖有介电材料，施加高压（5–100 kV，50 Hz–100 kHz）。DBD的实用优点包括反应器几何结构简单、可使用环境空气作为进料气、资本成本相对较低以及可批次或半连续操作。

2.2.2 大气压等离子体射流（APPJ）

APPJ在放电管内产生等离子体，并将等离子体聚焦成延伸至周围空气并到达种子表面的等离子体羽流。APPJ产生的等离子体空间定位精确，出水化学特征明确，适用于机理研究。其主要缺点在于处理通量低。

2.2.3 滑动弧放电（GAD）

GAD是一种独特的常压气相等离子体构型，电弧在发散电极之间引发并沿扩展放电区域位移。在豆类文献中，GAD已被应用于改善萌发和微生物去污。

2.2.4 等离子体活化水（PAW）

PAW应被视为与直接气相CP处理不同的处理方式，因为它是一种液相处理，通过将水暴露于等离子体源而产生。在活化过程中，RONS从等离子体转移到水相中。PAW的代表性浓度约为H₂O₂ 100–1000 μM、NO₂^? 100–5000 μM、NO₃^? 500–10,000 μM、ONOO^? 0–50 μM和溶解O₃ 0.1–2.0 mg/L。PAW的pH通常降至约2.5–5.0。与直接气相处理相比，PAW通过水介导的接触和吸胀作用递送溶解的RONS，为RONS通过种子表面结构和吸胀途径的转运提供了更大的机会。

2.2.5 比较工艺特征与种子–等离子体接触几何

DBD、APPJ和GAD均为气相CP技术，但其反应器几何、等离子体–种子接触模式和RONS暴露在本质上各不相同。O₃在空气中相对长寿命（20°C时约20–100分钟），而•OH等高度活性物种的有效寿命则短得多。种子水分也是一个重要的工艺变量。

2.3 关键活性物种及其生物学作用

多种RONS及其协同相互作用是CP对豆类种子产生生物学效应的原因。臭氧（O₃）是主要的长寿命氧化剂。过氧化氢（H₂O₂）在亚毫摩尔浓度下触发Ca²⁺内流、MAPK级联激活和ABA分解代谢酶上调，从而促进休眠解除和萌发。一氧化氮在1–100 nM范围内模拟天然NO激素信号传导。在PAW的酸性环境中，未解离亚硝酸（HNO₂，pK_a = 3.3）的浓度相当可观，通过亚硝化胁迫机制促进杀菌效应。

3 对种子萌发和幼苗活力的影响

3.1 萌发率、指数和平均萌发时间

CP处理对萌发和早期幼苗活力的影响现已涵盖所有重要的豆类作物。在最适的亚阈值剂量窗口内，CP处理通常能提高萌发率（Germination Percentage, GP）、萌发指数（Germination Index, GI）、幼苗活力指数（Seedling Vigour Index, SVI）、胚根长度和胚芽长度，并降低平均萌发时间（Mean Germination Time, MGT）。这些响应是hormetic的，且具有物种和剂量依赖性。在鹰嘴豆中，DBD处理（70 kV，3–5分钟）持续使GP较未处理对照提高12%–20%。在大豆中，APPJ等离子体处理（He/O₂，60 W，5分钟）使GP提高8%–15%，根长增加18%–24%。在普通菜豆中，PAW处理使GP提高14%，14天时地上部鲜重增加22%。Hormetic剂量–响应行为在不同豆类物种中一致观察到：较短的处理时间刺激萌发，较长的处理时间导致萌发逐渐受到抑制。

3.2 种皮改性与增强吸胀

CP增强萌发的关键物理过程是种皮基质的化学介导改性。X射线光电子能谱（XPS）和衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱一致显示CP处理后鹰嘴豆、小扁豆、大豆和普通菜豆种皮中极性含氧官能团增加18%–32%。扫描电子显微镜（SEM）结果捕捉到表面纳米孔形成和上表皮蜡质沉积物的部分侵蚀。这些化学和形态学变化使种皮从疏水性转变为亲水性，大幅提高了吸胀吸水速率和均匀性。

3.3 萌发过程中的激素信号传导与酶激活

除种皮效应外，CP处理还触发了调控萌发程序的激素和酶促通路。一氧化氮（•NO）促进脱落酸（Abscisic Acid, ABA）分解代谢，上调编码ABA 8′-羟化酶的CYP707A细胞色素P450基因。在CP处理的大豆胚轴中，赤霉素（Gibberellin, GA）生物合成基因（GA20ox、GA3ox）上调，导致生物活性赤霉素（GA₁和GA₄）增加20%–35%。CP处理还促进蛋白酶和植酸酶活性的提高。抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和抗坏血酸过氧化物酶APX）在CP处理的萌发种子中也增加15%–30%。

3.3.1 等离子体–植物激素共引发

CP和PAW的促萌发效应不仅归因于RONS递送；氧化还原和激素信号传导在吸胀过程中作为一个协调网络而非独立通路运作。在番茄中，PAW联合外源水杨酸（Salicylic Acid, SA）处理产生的改善效果优于单独处理，表明氧化还原和SA信号在早期幼苗发育过程中汇聚于共同的下游靶点。

3.4 冷等离子体作为非生物胁迫引发剂

CP种子生物学中最独特且研究最不充分的方面之一是其赋予对干旱、盐碱和低温胁迫的交叉耐受能力，即引发诱导的非生物胁迫耐受性。在干旱胁迫（30%田间持水量）下，经DBD处理的豌豆在播种后30天的地上部生物量比未处理植株高18%–24%，根深增加15%。CP处理的绿豆上调了盐过度敏感（SOS）通路相关基因和高亲和力钾转运蛋白（HKT1;1）基因，改善了Na⁺/K⁺稳态。在盐胁迫下，CP处理的绿豆中硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）降低了33%，膜完整性得以维持。在低温胁迫（8°C–15°C）下，DBD处理显著增强了根和地上部生长，这与CBF/DREB介导的冷响应转录因子网络激活有关。

4 对营养品质的影响

4.1 蛋白含量、结构与消化率

蛋白质占豆类种子干物质的18%–45%。经最适CP处理后，以体外蛋白消化率（In Vitro Protein Digestibility, IVPD）衡量的蛋白质营养价值持续提高，鹰嘴豆、小扁豆、大豆和普通菜豆较未处理对照提高12%–18%。其生化基础在于表面可及半胱氨酸残基和蛋氨酸侧链的选择性氧化，以及有限的骨架断裂和酪氨酸交联，导致紧凑三级和四级结构的破坏。经CP处理的大豆分离蛋白的SDS-PAGE分析显示，完整的7S和11S亚基随处理时间延长逐渐消失。傅里叶变换红外光谱酰胺I区分析表明α-螺旋构象含量降低而β-折叠构象比例增加。HPLC氨基酸分析显示，在最适CP条件下，必需氨基酸含量基本得以保留。根据世界卫生组织/粮农组织（WHO/FAO）推荐的可消化必需氨基酸评分（Digestible Indispensable Amino Acid Score, DIAAS），CP处理显著改善了豆类蛋白的营养价值。

4.2 淀粉结构与血糖消化率

豆类淀粉天然具有低血糖生成指数（Glycaemic Index, GI = 25–45）。CP处理通过表面氧化和颗粒外围结晶结构的部分破坏来改变淀粉结构。差示扫描量热法分析显示CP处理后豆类淀粉的起始糊化温度（T_o）和峰值温度（T_p）系统性降低2°C–5°C。X射线衍射图谱显示B型结晶度峰逐渐衰减。低剂量CP（≤3分钟）通过破坏淀粉颗粒表面提高体外淀粉消化率，而高剂量CP（≥8分钟）通过诱导直链淀粉链的氧化交联增加抗性淀粉（Resistant Starch, RS）组分。

4.3 脂质谱与氧化稳定性

豆类种子脂质含量范围广泛，从鹰嘴豆、小扁豆和普通菜豆的1.5%–6%到大豆的20%。CP对脂质氧化状态具有双相效应。在低处理强度（DBD ≤3分钟）下，CP使脂肪氧合酶（Lipoxygenase, LOX）活性降低20%–45%，己醛生成量减少25%–40%。在较高CP剂量（>8分钟）下，TBARS和过氧化值浓度显著增加。最适CP条件（DBD ≤5分钟）不会显著影响饱和脂肪酸比例，且亚油酸与α-亚麻酸的比例保持在营养学可接受范围内（<6:1）。

4.4 维生素与矿物质生物利用度

在最适处理条件下（DBD ≤5分钟，60–70 kV，或PAW ≤20分钟），叶酸和硫胺素的损失相对较小（分别为5%–12%和8%–15%），核黄素较易受影响。然而，最适CP处理持续改善了铁、锌、钙和镁的生物利用度，而总矿物质含量不变。这一看似矛盾的效应归因于CP介导的植酸同步降低。CP处理小扁豆的铁和锌透析率分别比未处理对照提高28%–42%和22%–35%。CP介导的草酸降低进一步改善了鹰嘴豆中钙的生物利用度。

5 抗营养因子的降低

5.1 植酸

植酸占豆类种子干物质的0.5%–5.0%，是二价阳离子的极强螯合剂。CP处理通过两种机制途径使豆类中植酸含量降低15%–35%：激活内源性植酸酶和•OH及ONOO^?自由基对磷酸酯键的直接化学水解。DBD处理鹰嘴豆（70 kV，5分钟）和PAW处理小扁豆（15分钟等离子体活化，4小时吸胀）分别使植酸降低22%和28%。CP预处理与萌发（25°C，5天）联用可将绿豆中植酸协同降低65%–70%。

5.2 胰蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂（Trypsin Inhibitors, TIs）主要包括Kunitz型和Bowman–Birk型。CP通过选择性修饰维持TI三级结构的二硫键，使豆类物种TI活性降低20%–40%。在大豆中，DBD处理（60 kV，5分钟）使Kunitz TI活性降低31%，Bowman–Birk TI活性降低27%，IVPD提高14%。在鹰嘴豆中，APPJ处理（He/空气，30 W，3分钟）使TI活性降低38%。

5.3 凝集素

凝集素是碳水化合物结合糖蛋白，在普通菜豆中含量最高（占种皮干重的0.5%–3.0%）。CP处理通过RONS选择性氧化凝集素碳水化合物识别域中的色氨酸和组氨酸残基，使普通菜豆的凝集素血凝活性降低30%–55%。

5.4 缩合单宁、皂苷和草酸盐

CP通过RONS介导的可溶性单宁低聚物氧化聚合成不溶性高分子量聚集体，使鹰嘴豆和小扁豆的缩合单宁含量降低18%–30%。CP通过断裂糖苷键使大豆和鹰嘴豆中皂苷水平降低15%–25%。CP通过草酸根二价阴离子的直接氧化脱羧，使豆类子叶中草酸晶体浓度降低20%–35%。

6 功能与加工功能特性

除营养化学外，CP对豆类种子蛋白和淀粉的改性显著改变了其加工功能特性。CP处理的鹰嘴豆粉和普通菜豆粉的吸水能力（Water Absorption Capacity, WAC）和吸油能力（Oil Absorption Capacity, OAC）分别提高8%–20%和10%–18%。泡沫能力（Foam Capacity, FC）和泡沫稳定性（Foam Stability, FS）在CP处理后提高15%–30%。小扁豆和鹰嘴豆浓缩蛋白的乳化能力提高12%–22%，乳化稳定性指数提高10%–18%。蛋白质溶解度为CP剂量的函数呈U型曲线。经CP处理的蛋白的表面疏水性增强，其凝胶形成能力得到提升。在最适处理条件下，总色差（ΔE）保持在不可察觉至勉强可察觉范围内（ΔE < 2.0）。

7 微生物去污与食品安全

豆类种子栖息着复杂的微生物群落，包括食品安全病原体、贮藏霉菌和散装腐败细菌污染物。CP提供四种互补的灭活机制：RONS介导的细胞膜磷脂氧化、必需膜相关酶和游离胞质蛋白的氧化失活、直接DNA链断裂和碱基氧化产物的形成，以及UV光子诱导的嘧啶二聚体形成。在鹰嘴豆种子中，DBD处理使接种的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium，10⁷ CFU/g）减少4.2 log₁₀ CFU/g。大豆种子上的大肠杆菌O157:H7（E. coli O157:H7）减少3.8 log₁₀。花生种子上的黄曲霉（Aspergillus flavus）孢子负荷减少3.5 log₁₀，同时黄曲霉毒素B₁含量降低65%。PAW实现了小扁豆种子的总好氧菌落数（Total Aerobic Plate Count, TAPC）减少3.1 log₁₀，真菌负荷减少2.9 log₁₀，萌发率同时提高12%。重要的是，在用于种子处理的典型CP处理强度下，未观察到沙门氏菌或大肠杆菌的适应性抗性基因表达。

8 作用机制

CP处理改变种子特性的生物物理和生物化学机制在从亚纳米尺度的RONS表面相互作用到宏观尺度的整粒种子表型变化的时空尺度上发挥作用。数学扩散–反应模型表明，在典型的DBD条件下，仅有不到5%的气相RONS到达种皮外层50–100 μm以外的区域，这定量地说明内部营养优势通过随后吸胀水中的RONS反应而显著增强。气相RONS与种皮外层的聚合物基质（角质和木栓质）反应。在细胞间信号传导水平，亚致死浓度的H₂O₂和•NO通过增强的吸胀通道进入，激活保守的植物胁迫信号传导。CP对蛋白质改性的化学机制涉及含硫残基侧链的氧化和疏水侧链α-碳的氢原子抽提，在低CP剂量下产生部分解折叠的构象。

9 可持续农业意义

冷等离子体种子处理融合了可持续农业的多项原则。

9.1 资源利用效率与投入减少

CP提高了萌发的均匀性和快速性，降低了补种和补苗作业的需求，使种子投入成本降低8%–15%。CP改良的豆类根系结构使灌溉需水量降低。CP处理的能耗需求较低，DBD通常为0.1–0.5 kWh/kg种子。

9.2 气候韧性与非生物胁迫

在全球气候快速变化的背景下，非生物胁迫耐受性增强具有重要意义。CP引发不需要基因改造或监管性生物技术审批，也不涉及专有种子许可，降低了小农耕作体系采用的门槛。CP引发对多种非生物胁迫具有交叉耐受性。

9.3 共生固氮增强

CP增强共生固氮（Symbiotic Nitrogen Fixation, SNF）涉及三个相互关联的过程：种皮表面氧化促进根瘤菌附着和侵染线启动；亚毒性浓度的CP诱导•NO模拟内源性•NO爆发以诱导nod基因表达；CP建立了一种“共生兼容的免疫引发”状态。DBD等离子体处理的普通菜豆种子（60 kV，10分钟，空气）在播种后30天的结瘤效率和地上部氮含量分别提高18%和14%。CP处理大豆的固氮酶活性较未处理植株提高22%。

9.4 种子微生物组调控

种子微生物组是影响幼苗建植、抗病性和作物生产力的一个被忽视的重要因素。CP处理代表了一种独特的选择性微生物组调控干预手段：不同微生物类群间差异性的RONS敏感性创造了选择性压力。CP处理种子的16S rRNA扩增子测序表明，病原性假单胞菌目相对丰度显著降低，而促进植物生长的芽孢杆菌科和放线菌目丰度增加。

9.5 CP-芽菜生产：豆类芽菜和微型蔬菜

豆类芽菜和微型蔬菜是最快速增长的生鲜产品市场之一。CP种子处理联合PAW预处理实现了三个关键结果：去污、加速和同步萌发，以及营养和生物活性化合物组成增强。小扁豆种子在萌芽前用PAW处理（30分钟种子吸胀，pH 3.2–4.5）使病原体负荷减少3.1 log₁₀/g，γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid, GABA）增加高达52%，总酚含量增加高达35%，植酸降低高达26%，种子出苗同步性改善高达20%。未经处理的萌发瓜尔豆种子在5天萌发中获得了最大萌发能力、降低的ANFs和更高的IVPD。

10 安全性考量与监管框架

CP处理豆类种子的安全性应从三个方面评估：化学危害可能性、工人防护和监管状态。在适当的处理后通风条件下，CP处理种子中残留的臭氧在常温常湿下30–60分钟内消散至环境背景水平（<0.1 mg/kg）。PAW加工种子中亚硝酸盐（NO₂^?）的积累更令人担忧。在最适CP处理的豆类蛋白分离物中，蛋白羰基含量增加15%–30%，但仍远低于报道的具有不良生物学效应的限值。除氧化和亚硝化标志物外，致敏性和职业暴露是需要明确处理的安全性维度。Ames试验和彗星试验在有限的研究中未发现CP处理鹰嘴豆和大豆提取物的显著遗传毒性活性。CP在食品加工中的监管在不同监管区域存在显著差异。

11 挑战、放大与未来展望

11.1 反应器工程与放大

商业化的最大技术障碍是规模放大。连续流反应器、转鼓电极或流化床等离子体反应器在提高物料处理量和处理均匀性方面具有工程潜力，但每条加工线的资本成本较高（150,000–500,000美元）。PAW系统提供了一种替代的放大选择。

11.2 剂量标准化与过程控制

CP缺乏普遍接受的食品表面处理剂量指标。优先标准化需求包括商定的RONS浓度直接测量规程、标准化种子暴露几何要求和具有已知初始微生物负荷的参考种子材料。国际标准化机构（ISO、IEC和AOAC国际）和监管机构（EFSA和FDA）的参与至关重要。

11.3 物种特异性优化与AI辅助工艺开发

CP处理参数的优化高度依赖于物种和品种。响应面法（Response Surface Methodology, RSM）和人工神经网络（Artificial Neural Network, ANN）建模为加速识别满足多个品质终点的最佳条件组合提供了途径。高通量表型分析可加速预测模型训练的数据收集。转化研究中最重要的需求是对CP处理营养益处的临床验证。

11.4 生命周期评估与技术经济分析

亟需对CP种子处理进行全面的生命周期评估（Life Cycle Assessment, LCA）。CP种子去污与常规高压蒸煮和化学消毒处理的对比LCA研究可提供客观信息。CP-芽菜系统的技术经济建模需考虑PAW生产成本、萌发室运行成本和认证CP处理芽菜产品的溢价定价。

12 结论

冷等离子体的应用已超越实验室新奇阶段，成为一种具有科学良好表征和技术前景的种子处理平台。本综述以独特方式整合了CP–豆类相互作用的三个此前未被纳入综合文献综述的方面。就非生物胁迫引发而言，CP是一种具有潜在变革性的气候适应种子技术。CP通过表面改性、•NO信号传导和共生免疫引发适应三条平行途径增强固氮作用。CP对种子微生物组的调控提出了全基因组引发框架。CP-芽菜概念将PAW预处理的安全性与受控萌发相结合，是最具即时商业化前景的应用。未来需要开展严谨的放大工程研究、国际等离子体剂量指标的标准化、全面的生命周期和技术经济分析、支持矿物质生物利用度和GABA含量增强声称的临床试验，以及利用宏基因组学新技术系统研究CP对种子微生物群落的影响。