《Environmental Science: Nano》：Sustainable essential oil–halloysite nanotube dispersions exert highly effective pest control activity with minimal phytotoxicityOpen Access
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合成农药的密集使用已引发严重的环境和人类健康问题，并加速了抗药性害虫种群的出现。精油（Essential Oils, EOs）作为源自植物的天然化合物，具有强效的抗菌和杀虫活性，是作物保护中极具前景的可持续替代方案。然而，其实际应用受到高挥发性、水溶性差、环境
合成农药的密集使用已引发严重的环境和人类健康问题，并加速了抗药性害虫种群的出现。精油（Essential Oils, EOs）作为源自植物的天然化合物，具有强效的抗菌和杀虫活性，是作物保护中极具前景的可持续替代方案。然而，其实际应用受到高挥发性、水溶性差、环境不稳定性和潜在植物毒性的限制。本研究提出了一种基于协同EO组合水分散体的多功能植物保护策略，其中天然丰富的管状铝硅酸盐黏土——埃洛石纳米管（Halloysite Nanotubes, HNTs）被用作EO载体和界面稳定剂。将EO负载到HNTs中可增强热稳定性并有助于保留生物活性化合物，同时HNTs在油-水界面的吸附赋予Pickering型稳定效应，促进稳定水分散体的形成并减轻植物毒性。初步筛选确定香芹酚（Carvacrol, CV）、百里香酚（Thymol, TY）、肉桂醛（Cinnamaldehyde, CA）和香叶醇（Geraniol, GE）是对植物病原细菌胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）、真菌病原灰葡萄孢（Botrytis cinerea）及害虫最具效力的EO组分。随后确定了TY:CA和TY:GE两种协同EO组合并将其负载至HNTs中。研究人员对所得制剂的结构、稳定性和生物学性能进行了表征，并在实验室和田间条件下评估了其在植物叶片上的表现。田间规模试验表明，HNT/TY:GE（1:4）制剂对模式蚜虫和叶螨表现出强杀虫活性，在2.0%（w/w）EO含量下于所测短期条件下实现了>85%的死亡率。其 efficacy 相当或优于所测商业杀虫剂，同时相较于相应EO乳液表现出更低的植物毒性。抗真菌试验进一步揭示了显著活性，降低了辣椒植株上的病害发生率和真菌定殖。
一、研究背景与科学问题
合成农药的广泛和重复使用虽有效控制了植物病原细菌、真菌及害虫并保障了作物产量，但其高毒性已引发严重的生态和毒理学关切。环境中农药残留频繁超标，对非靶标生物、生态平衡和生物多样性造成不利影响，同时加速了抗药性害虫和病原菌种群的出现。作物同时面临多种生物胁迫因子的威胁，如蚜虫等刺吸式害虫可直接危害植物并传播病毒，而植物病原细菌和真菌则可造成毁灭性病害，导致减产和经济损失。因此，亟需开发能同时应对多种生物胁迫且最大限度降低生态和毒理学影响的多功能广谱作物保护策略。
天然植物源生物活性化合物，特别是精油，已被证实具有广谱抗菌、抗真菌、抗氧化和杀虫活性，其中含氧萜类（如百里香酚、香芹酚、香叶醇等）和苯丙素类（如肉桂醛、丁子香酚）是最有效的组分。尽管EOs具有作为合成农药替代品的巨大潜力，但其高挥发性、亲脂性、水溶性差、化学不稳定以及在高浓度应用时可能产生的植物毒性，严重限制了其农业实际应用。已有多种纳米递送系统被探索用于解决这些问题，但许多平台依赖合成组分或涉及有机溶剂和多步骤制造工艺，增加了制剂复杂性并限制了农业规模化应用。
在这一背景下，黏土基载体因其理化性质、丰度、低成本和可持续性而备受关注。其中埃洛石纳米管是天然存在的铝硅酸盐矿物，具有管状结构、介孔结构和较大的比表面积，为生物活性化合物的吸附和负载提供了优异的性能。已有研究表明，将EOs负载入HNTs可显著提高其热稳定性并实现缓释效果。在农业领域，HNTs正被研究作为肥料、除草剂和杀虫剂等多种农用化学品的通用递送系统，通常表现出延长活性和增强功效的效果。然而，以往研究主要将HNTs单独用作单一生物活性化合物的载体或Pickering稳定剂，生物学评价多限于狭窄范围的靶标生物。本研究旨在开发基于协同EO组合的水性可喷洒EO负载HNT分散体用于叶面作物保护，使HNTs同时发挥挥发性EO纳米载体和油-水界面Pickering型稳定剂的双重功能，并纳入具有协同抗微生物活性的EO混合物以拓展制剂对多种作物相关生物胁迫因子的活性谱。
二、研究内容与主要方法
研究人员首先通过肉汤微量稀释法测定了七种EO组分对胡萝卜软腐果胶杆菌和灰葡萄孢的最低抑菌浓度，并以蚜虫为靶标评估了其杀虫活性。随后采用棋盘法筛选EO组合的协同抗菌作用，并通过植物毒性试验评估了单一及组合EO对辣椒幼苗的安全性。基于筛选结果，研究人员采用实验室前期开发的简便方法将协同EO组合负载入HNTs，利用高分辨热重分析表征了复合物的热稳定性。采用荧光标记结合共聚焦激光扫描显微镜观察了分散体中HNTs在油-水界面的分布，利用LUMiSizer分散分析仪评估了制剂的胶体稳定性。通过高分辨扫描电镜耦合能谱分析了叶面施用后HNTs的沉积形态与元素组成。在实验室和田间两个尺度上评估了制剂的杀虫活性和植物毒性，并在盆栽实验中评估了针对灰葡萄孢的抗真菌效果。供试菌株包括从马铃薯分离的P. carotovorum subsp. brasiliensis和来自酿酒葡萄的B. cinerea B05.10菌株；供试昆虫包括棉蚜、桃蚜和二斑叶螨，均购自以色列Biobee公司；植物材料（番茄幼苗、法国龙蒿插条、摩洛哥薄荷和辣椒幼苗）均购自以色列Hishtil有限公司；商业对照杀虫剂为Totach（含印楝油和除虫菊酯）和Teppeki?（氟啶虫酰胺）。
三、主要研究结果
（一）单一EO的抗菌和杀虫活性筛选
CV和TY对两种病原体表现出最强的抑制作用，CV对P. carotovorum和B. cinerea的MIC分别为150 μg mL?1和100 μg mL?1，TY对两种病原体的MIC均为150 μg mL?1。CA也表现出抗菌活性，对两种病原体的MIC均为200 μg mL?1。丁子香酚和GE虽能抑制供试病原体，但效力较低。芳樟醇和d-柠檬烯在测试条件下未表现出抗菌活性。杀虫活性方面，CV、TY和CA实现了100%的蚜虫死亡率，丁子香酚和GE达到90%的死亡率。
（二）EO组合的抗菌活性
棋盘法分析表明，TY（50 μg mL?1）与CA（100 μg mL?1）的组合以及TY（50或100 μg mL?1）与GE（200或100 μg mL?1）的组合实现了对P. carotovorum的完全抑制，其∑FIC值等于或低于1，提示TY:CA在1:2比例以及TY:GE在1:4和1:1比例下存在互补的相互作用。TY与CV的组合对两种病原体均表现为相加效应而非协同效应，这与结构相似酚类化合物混合时倾向于产生相加效应的既往报道一致。
（三）单一及组合EO的植物毒性
在5000 μg mL?1浓度下两次叶面施用后，多数处理在第14天的平均植物毒性评分有所增加。单一EO中CV、TY和GE的评分最高。值得注意的是，TY:GE混合物（两种研究配比）的植物毒性低于其各单一组分，表明特定EO组合能够调节植物毒性，在生物活性和植物健康之间提供更均衡的剖面。
（四）EO负载HNTs的制备与表征
TGA分析显示，纯TY-GE混合物呈现单步失重，在约170°C时完成。相比之下，HNT/TY:GE复合物表现出多步失重行为，EO的完全损失发生在约400°C的显著更高温度下，证实HNTs大幅提高了挥发性EOs的热稳定性。复合物中EO含量测定为57 wt%，表明制备过程中保留了约95%的初始EO量。
（五）HNT/EO分散体的结构与稳定性
CLSM观察证实了HNTs在油-水界面的定位，形成了明显的界面层，作为Pickering稳定剂减少油滴聚结。图像定量分析显示，HNT/TY:GE分散体的平均液滴尺寸为2.3 μm，小于TY:GE乳液的2.7 μm，SPAN值从1.0降至0.6，表明HNTs的加入增强了液滴均匀性。LUMiSizer稳定性分析显示，HNT/TY:GE分散体和TY:GE乳液均表现出类似的低不稳定指数，提示良好的胶体稳定性。这些结果证实了HNTs在制剂中的双重功能：作为EO封装的纳米载体以及作为Pickering稳定剂。
（六）叶面施用后叶片表面的表征
HR-SEM观察显示，施用HNT/TY:GE分散体的叶片表面存在离散的颗粒沉积物，高倍镜下可见管状HNTs的小聚集体，EDS分析证实了这些颗粒的组成确为铝硅酸盐HNTs。在HNT/EO和纯HNT分散体处理中，均未观察到可见的角质层损伤或气孔阻塞，叶面气孔保持开放。相比之下，TY:GE乳液处理与气孔开度减小相关，提示游离EO可能引发局部应激反应。
（七）田间规模植物毒性研究
田间试验在以色列Hishtil有限公司的营养繁殖苗圃进行，以商业母株的摩洛哥薄荷插条为试材。TY:CA（1:2）相关处理导致严重损伤（评分4-5）。HNT/TY:GE（1:1）在2.0%（w/w）EO浓度下未见可见损伤（评分0），而相应乳液引起部分叶片黑化（评分2）。HNT/TY:GE（1:4）在2.0%（w/w）EO下无可见植物毒性效应（评分0），在2.5%（w/w）EO下仅表现出极轻微损伤（评分1），而相应EO乳液在2.5%（w/w）EO下导致评分为3.5的显著损伤。移栽生根11天后，EO负载HNT分散体处理的插条表现出更密集、更翠绿的叶片和改善的营养生长，而相应EO乳液经常造成边缘灼伤和生长减少。
（八）杀虫活性
接触生物测定表明，所有供试制剂均表现出剂量依赖性杀虫活性。HNT基分散体在2.0%（w/w）EO含量下实现比相应EO乳液更高的蚜虫死亡率。其中HNT/TY:GE（1:4）制剂表现出最强的杀虫活性，在2.5%（w/w）EO含量下达99%的蚜虫致死率，优于HNT/TY:GE（1:1）和HNT/TY:CA（1:2）组合。
（九）田间防治效果
选用HNT/TY:GE（1:4）分散体（2.0%（w/w）EO）进行田间比较试验，以Totach和Teppeki?两种商业杀虫剂为对照。对辣椒幼苗上蚜虫的试验中，HNT/TY:GE分散体实现了最高的蚜虫死亡率（约86%），优于Totach（约52%）和Teppeki?（<30%）。对法国龙蒿插条上叶螨的试验中，HNT/TY:GE分散体与Totach效果相当，均实现了接近100%的死亡率。
（十）针对灰葡萄孢的抗真菌活性
HNT/TY:GE（1:4）分散体在辣椒幼苗上将病害发生率降至仅7%，相较于HNT分散体对照降低约12倍，相较于水对照降低约8倍，差异具有统计学显著性。CFW染色荧光显微镜观察显示，对照叶片中形成了致密的真菌菌丝网络，而HNT/TY:GE分散体和TY:GE乳液处理的叶片表现出更低的荧光信号和减少的菌丝密度。
四、讨论与结论
本研究表明，将TY:GE混合物负载至HNTs中可显著提高这些高挥发性化合物的热稳定性。结构表征揭示了纳米管关键的界面作用——HNTs定位于油-水界面充当Pickering稳定剂，与Tween 80协同稳定油滴，防止聚结。叶面施用后，EO负载HNT颗粒在叶片表面均匀沉积，未诱导可见的气孔阻塞或角质层损伤。田间试验中，HNT/TY:GE（1:4）制剂对蚜虫和叶螨表现出强杀虫活性，在2.0%（w/w）总EO浓度下实现>85%的害虫死亡率，效果相当或优于商业杀虫剂，同时较相应EO制剂（不含HNTs）表现出更低的植物毒性。抗真菌实验进一步证明该制剂显著降低了灰葡萄孢的病害发生率和真菌定殖，支持了制剂的广谱保护潜力。研究人员指出，虽然TY:GE比例是基于抗菌协同作用确定的，但该制剂同时表现出优异的杀虫性能。值得注意的是，EO负载HNT分散体在实际应用中仍需进一步验证，未来研究应关注长期田间表现、环境归趋与持久性、对有益生物体的潜在影响以及对更广泛的重要经济病原体和害虫的活性，同时开展EO释放行为、HNT-EO相互作用和植物响应途径的机制研究，以进一步阐明制剂效力和安全性的基础。
结论：本研究证明了EO负载HNT制剂作为多功能、可持续作物保护剂的潜力，其整合了抗菌和杀虫活性并兼具良好的植物毒性特征。初步筛选确定了TY、CV、CA和GE是对P. carotovorum、B. cinerea和蚜虫害虫最有效的单一EO。在此基础上，确定了TY:CA和TY:GE协同EO组合，在降低EO浓度下表现出增强的抗菌效力。将TY:GE混合物掺入HNTs显著提高了这些高挥发性化合物的热稳定性。水分散体的详细结构表征揭示了纳米管关键的界面作用；共聚焦显微镜证实HNTs定位于油-水界面，充当Pickering稳定剂。叶面施用导致EO负载HNT颗粒在叶片表面均匀沉积，未诱导可见的气孔阻塞或角质层损伤。在多种模式植物上的田间试验显示，HNT/TY:GE（1:4）制剂对蚜虫和叶螨表现出强杀虫活性，在2.0%（w/w）总EO浓度下实现>85%的害虫死亡率，性能相当或优于商业杀虫剂，同时保持比相应EO制剂更低的植物毒性。此外，抗真菌实验表明其显著降低了辣椒幼苗上B. cinerea的发病率和真菌定殖，支持了这些制剂广谱保护的潜力。这些结果突显了EO负载HNT分散体作为传统化学农药的环境可持续替代品的潜力。负载至纳米载体中的EO组成是可调的，允许制剂针对不同害虫和病原体进行适应性调整。
