硅藻土纳米颗粒经营养级传递驱动的捕食者风险可被dsRNA安全开关缓解

《Environmental Science: Nano》：Trophic transfer-driven predator risk from diatomite nanoparticles is mitigated by a dsRNA safety switchOpen Access

　　

摘要专业翻译 硅藻土广泛用于害虫治理及其他工业应用，但其非靶标生态风险仍未得到充分解析。研究人员利用捕食者–猎物微宇宙模型（Xylocoris flavipes 与 Tribolium castaneum）证明，硅藻土纳米颗粒（DNP）对捕食者的影响主要通过营养级传递产生，即捕食者取食经DNP暴露的猎物后受到伤害。捕食者死亡率随猎物预处理剂量的增加而升高，且营养级传递途径下的死亡率高于共存暴露途径，表明食物网传递是驱动捕食者死亡的主导途径。为在保持害虫防治效果的同时减轻非靶标效应，研究人员通过APTES硅烷化和静电吸附开发了负载双链RNA（dsRNA）的DNP制剂（dsRNA@DNP）。dsRNA@DNP对T. castaneum保持致死活性，同时在营养级暴露期间显著降低捕食者死亡率。释放实验表明，在低离子强度和所测pH条件下dsRNA大部分保持与DNP结合，但在高离子强度下显著释放，与可逆静电结合一致。基因表达分析显示捕食者中Chc表达降低，而猎物中未检测到明显降低。这些发现表明营养级传递是硅藻土纳米颗粒非靶标效应的重要途径，并展示了一种安全设计策略，可在维持猎物抑制的同时降低捕食者死亡率。

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一、研究背景与科学问题

硅藻土（DE）作为一种低成本矿物材料，在农业害虫防治及过滤、吸附、功能添加剂等工业领域应用广泛。在害虫管理中，硅藻土常被视为传统合成化学农药的低风险替代品，其作用机制通常被描述为物理性杀虫。然而，越来越多的证据表明，颗粒尺寸、表面性质和暴露情境可显著影响其生物学效应和环境风险。商业硅藻土产品并非均一粉末，通常含有多种粒径的颗粒，其中纳米级组分（DNP）在生物系统中的行为可能与大颗粒不同。研究人员前期工作已报道DNP可在昆虫中引起依赖摄取过程的细胞毒性，且与网格蛋白介导的内吞作用相关，提示DNP可能存在超越经典机械作用模式之外的效应机制。

对于农业生态系统中使用的纳米功能材料，一个关键问题是其影响是否不仅限于靶标害虫，还会波及非靶标生物，包括有益捕食者。现有风险评估往往侧重于直接暴露途径，但间接途径同样重要。特别是，如果纳米颗粒在猎物表面或体内存留并被捕食者取食，就可能发生食物网或营养级传递。在此类情况下，捕食者风险可能更多由取食行为驱动，而非与材料的直接接触。然而，营养级传递作为风险途径的重要性以及可行的缓解策略仍不明确。

二、研究内容与主要结论

本研究利用由仓储捕食性花蝽Xylocoris flavipes及其猎物赤拟谷盗Tribolium castaneum组成的捕食者–猎物微宇宙模型，系统评估了DNP的非靶标效应。研究首先比较了不同暴露情境下的捕食者结局，以区分共存效应与营养级传递效应，并检验捕食者死亡率是否随猎物预处理剂量增加而升高。随后，研究人员基于安全设计理念开发了缓解策略：通过静电吸附将dsRNA负载到氨基功能化的DNP上（dsRNA@DNP），该制剂旨在保持对猎物的抑制效果，同时降低对捕食者的不利影响。通过将暴露途径测试与基于dsRNA的缓解策略相结合，本研究阐明了纳米颗粒如何通过营养级相互作用传播非靶标效应，并为减少食物网相关效应同时维持害虫抑制提供了潜在途径。

三、关键技术与方法

本研究涉及以下主要技术方法：其一，DNP的分离制备，通过0.45 μm滤膜过滤从硅藻土粉末中收集纳米级组分，并经离心洗涤干燥获得；其二，dsRNA的体外合成，采用T7 RiboMAX Express RNAi系统通过体外转录制备；其三，dsRNA@DNP制剂的构建，通过APTES硅烷化对DNP进行氨基功能化（APTES-DNP），再利用静电吸附将dsRNA负载到颗粒表面；其四，颗粒表征技术，包括扫描电子显微镜（SEM）观察形貌、动态光散射（DLS）测定水合粒径和ζ电位；其五，dsRNA负载量与释放行为的定量分析，采用Qubit RNA HS检测结合质量平衡计算；其六，qPCR基因表达分析，检测捕食者和猎物中靶标基因的相对表达水平；其七，微宇宙生物测定体系，在500 mL玻璃罐中以全麦粉为基质构建捕食者–猎物暴露系统。昆虫品系为实验室饲养的X. flavipes成虫（3–5日龄）和T. castaneum幼虫（5–6龄）。

四、研究结果

4.1 营养级传递是驱动捕食者死亡的主导途径

研究人员在捕食者–猎物微宇宙中比较了三种暴露途径下X. flavipes的结局：对照取食、共存暴露和营养级传递。第4天时，对照组平均累计死亡率为18%，共存暴露组为48%，营养级传递组达74%。差异在早期即已显现（第1天分别为6%、12%和28%），至第2天更为显著（8%、32%和60%），表明在所测条件下营养级传递对捕食者死亡的驱动作用强于共存暴露。剂量–反应实验显示，捕食者第4天死亡率随猎物预处理剂量单调递增，从对照组6%升至0.75 g kg?1时的48%、1.5 g kg?1时的74%和3.0 g kg?1时的94%。进一步实验表明，无猎物时无论有无DNP，捕食者第2天死亡率均保持较低水平（无DNP为6.7%，有DNP为3.3%）；而存在猎物时，无DNP组死亡率仍低（6.7%），但猎物与DNP共存时死亡率显著升高至36.7%。这些结果证实猎物介导的暴露是产生显著捕食者死亡率的必要条件，支持营养级传递为主导途径。

4.2 DNP的形貌与粒径分布

SEM成像显示所分离DNP组分的颗粒形貌，包括小颗粒和较大聚集体。DLS显示以纳米尺度水合粒径为主的分布，主强度峰约100 nm。DNP平均水合直径为108 ± 3 nm，多分散指数（PDI）为0.23 ± 0.02。

4.3 dsRNA@DNP的制备与表征

研究人员先制备氨基功能化载体（APTES-DNP），再通过静电吸附负载dsRNA。颗粒表征支持表面修饰和dsRNA结合的成功实现。天然DNP水合直径为108 nm，ζ电位为?19 mV；APTES硅烷化后水合直径增至134 nm，ζ电位反转为+21 mV；dsRNA吸附后水合直径进一步增至168 nm，ζ电位趋近中性（+6 mV），与带负电dsRNA吸附到带正电颗粒表面一致。质量平衡定量显示，天然DNP在相同负载流程下吸附的dsRNA较少，而APTES-DNP的dsRNA负载量显著更高，从天然DNP的7.4 μg mg?1增至APTES-DNP的64.8 μg mg?1，证明APTES功能化大幅增强dsRNA结合能力。释放实验显示，dsRNA在无核酸酶水和PBS中释放率较低（均值分别为8.6%和10.6%），而0.5 M NaCl高盐挑战诱导大量释放（62.6%）。pH依赖性释放实验中，pH 5、7、9下平均释放率分别为9.0%、14.3%和17.7%，pH 5下显著低于pH 7和pH 9，而pH 7与pH 9之间无显著差异。在所测pH范围内超过80%的负载dsRNA保持与DNP结合。这些结果与dsRNA和APTES-DNP之间的可逆静电结合一致，表明制剂在低盐和所测pH条件下大部分保持结合状态，而在高离子强度下具有更强的可逆释放性。

4.4 dsRNA@DNP在营养级传递中缓解捕食者死亡同时保持猎物控制

取食DNP预处理猎物的捕食者第4天死亡率高达72%，对照组仅6%。APTES-DNP预处理猎物组捕食者死亡率仍高（66%），dsEgfp@DNP预处理组为70%。相比之下，取食dsXfChc@DNP预处理猎物的捕食者死亡率显著降低至16%。这些结果表明dsRNA@DNP安全开关可在营养级暴露下大幅降低捕食者死亡率，且缓解效应与靶向Chc的dsRNA相关，而非单纯dsRNA负载本身。在平行猎物生物测定中，DNP和dsRNA@DNP制剂对猎物产生相当的死亡率：DNP为53.6%，APTES-DNP为52%，dsXfChc@DNP为55.2%，dsEgfp@DNP为54.8%，未处理对照为5.0%。这表明将dsRNA负载到DNP并使用捕食者靶向dsRNA并未在测试条件下降低DNP对T. castaneum的致死活性。基因表达分析显示，猎物经dsXfChc@DNP暴露后靶标基因相对表达无明显变化，而取食dsXfChc@DNP预处理猎物的捕食者靶标基因表达相对捕食者对照降低37%，支持捕食者中Chc的选择性敲低。

4.5 dsRNA安全策略的拟议机制

dsXfChc@DNP的保护效应与捕食者特异性降低对DNP的易感性一致。取食dsXfChc@DNP暴露猎物的捕食者表现出Chc表达降低和死亡率大幅下降，而猎物中Chc表达未检测到明显降低，猎物死亡率在各处理间相当。这些结果支持营养级递送的dsXfChc在捕食者中抑制Chc而不损害DNP对猎物毒性的模型。基于前期将网格蛋白相关过程与DNP毒性联系起来的发现，Chc表达降低可能减少捕食者中DNP的摄取和随后的细胞毒性。但本研究未直接测量DNP摄取，该机制部分尚待实验证实。

五、讨论与结论

本研究结果凸显了颗粒型和纳米功能型害虫材料的一个核心生态毒理学要点：非靶标风险可能更多由捕食者–猎物相互作用驱动的食物网传递所决定，而非直接接触暴露。仅关注处理基质接触的评估可能在主要暴露途径为取食暴露猎物时低估危害。本研究所用微宇宙框架为在受控条件下捕获营养级暴露提供了实用方法，可广泛用于其他可能通过食物网传递放大非靶标效应的颗粒材料间接暴露途径评估。

从风险缓解角度，dsRNA@DNP代表一种安全设计策略，针对途径相关结局而非降低整体活性。通过将具备递送能力的颗粒平台与序列特异性dsRNA信号耦合，该方法提供了减少捕食者影响同时维持猎物抑制的模块化途径。制剂依赖简单的表面功能化步骤实现dsRNA结合和盐可逆行为，为未来优化dsRNA保留和释放提供了可操作的调控手段。

研究存在若干局限性：实验在实验室面粉微宇宙中进行，更复杂的基质和更长时间尺度可能改变暴露动态、dsRNA持久性和营养级传递行为；dsRNA–DNP结合在营养级传递过程中的体内命运尚未明确，捕食者Chc敲低表明功能性dsRNA到达捕食者，但未确定dsRNA在猎物体内是否保持颗粒结合、被释放或部分降解；Chc参与基础细胞过程，其敲低可能影响未评估的亚致死性状，如取食、运动、繁殖和长期适合度；实际应用将取决于dsRNA生产和DNP功能化的成本与可规模化性。

研究结论为：营养级传递是硅藻土纳米颗粒非靶标效应的重要途径；将靶向捕食者Chc的dsRNA负载到DNP上形成的dsRNA@DNP制剂，可在维持对猎物T. castaneum致死活性的同时显著降低捕食者X. flavipes在营养级暴露中的死亡率；该策略支持以安全设计方式缓解纳米功能害虫材料的具体非靶标效应。