《Environmental Science: Water Research and Technology》：Passive samplers coupled with digital PCR uncover zoonotic viruses in freshwaters of ‘excellent’ microbiological qualityOpen Access
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水生生态系统处于人类-动物-环境界面，可成为人畜共患病毒的来源和传播途径，然而在低人为干扰的淡水系统中，病毒监测仍受到方法学限制。被动采样器（passive samplers, PS）提供了一种时间整合型替代瞬时采样的方案，但其在淡水中的应用仍缺乏充分研究。本
水生生态系统处于人类-动物-环境界面，可成为人畜共患病毒的来源和传播途径，然而在低人为干扰的淡水系统中，病毒监测仍受到方法学限制。被动采样器（passive samplers, PS）提供了一种时间整合型替代瞬时采样的方案，但其在淡水中的应用仍缺乏充分研究。本研究优化了一套被动采样器工作流程，比较了四种核酸提取策略，评估了病毒浓度、pH值和总有机碳（total organic carbon, TOC）对病毒吸附的影响，并在受保护的城郊河流中验证了优化方案。提取前合并三张膜可获得最稳定的性能，并显著改善定量结果。微观世界实验（microcosm experiments）确定pH值是病毒吸附的主要驱动因素，在中性条件（pH 7.5）下回收率最高，而TOC产生次要效应。在测试范围内，病毒浓度的影响有限。现场应用可检测到人腺病毒（human adenovirus, HAdV）和戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）。HEV仅通过（RT）dPCR检测到，而（RT）qPCR未能检出，凸显了耐抑制物方法的重要性。测序证实为人畜共患HEV基因3型。重要的是，在基于粪便指示菌被分类为水质良好或优良的采样事件中仍检出了HEV。这些发现表明，被动采样器结合灵敏的分子方法可捕获低水平和偶发性的病毒污染，而其性能受到环境条件的强烈影响。本研究为在一体健康（One Health）视角下将病毒监测纳入水质评估提供了实用框架。
**被动采样器与数字PCR联用揭示“优良”微生物学水质淡水中的人畜共患病毒——一项方法学优化与野外验证研究**
**一、研究背景与科学问题**
水生态系统处于人类-动物-环境界面的交汇点，在人畜共患病原体的循环和传播中发挥着关键作用。河流、湿地和保护区持续接收来自野生动物、家畜和人类活动的微生物输入，使具有公共健康和兽医健康意义的病毒进入这些环境。在扩散性、间歇性且难以检测的输入源为主的流域中，表征病毒污染动态在一体健康框架下日益重要。
然而，地表水病毒监测仍面临严峻挑战，主要原因是病毒浓度通常较低且波动剧烈。传统瞬时采样仅能提供某一时间断面的快照，易遗漏短期污染事件，可能导致对病毒暴露风险的低估。被动采样器（PS）作为一种时间整合型采样工具应运而生，通过部署期间的累积效应整合病毒信号，其操作简便、成本低廉且适用于偏远地区，特别适合低人为干扰或受保护生态系统的监测。
尽管被动采样器已在污水、地下水、海水和湿地中得到成功应用，淡水系统的相关研究仍相对不足。方法学和环境层面的不确定性限制了其标准化和更广泛应用。病毒定量和检测灵敏度可能受到提取方案、膜性质和环境因素的影响，尤其是pH和总有机碳（TOC），这些因素通过调控静电相互作用、表面特性和吸附位点可用性来影响病毒吸附行为。然而，这些因素对病毒吸附的影响仍缺乏系统认识。与此同时，分析灵敏度可能因分子检测平台的不同而存在差异，定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）在复杂环境基质中对抑制物的耐受性和低丰度靶标的检测能力有所不同。这些不确定性共同阻碍了被动采样结果的解读，限制了针对低人为干扰水生环境建立稳健监测策略的进程。
人畜共患病毒因其可由多种宿主排出并在水生系统中持续存在，成为环境监测的重要靶标。戊型肝炎病毒（HEV）因宿主范围广且具有公认的人畜共患潜力而备受关注，HEV基因3型和4型在家养和野生动物中循环，并可通过包括受污染水体在内的环境暴露途径传播给人类。在欧洲，尤其是加泰罗尼亚地区，不断增长的野猪种群可能助长了人畜共患病原体的环境传播，构成城郊流域病毒污染的潜在来源。轮状病毒A（RoV-A）作为另一种重要的人畜共患靶标，是全世界人类和动物胃肠炎的主要病因。为对比这些多宿主人畜共患动态，人腺病毒（HAdV）作为人类特异性病原体被纳入研究，其已被广泛确立为环境基质中人类粪便污染的可靠指示物。
基于上述背景，本研究旨在：（i）比较核酸提取策略以优化被动采样器的病毒定量；（ii）在受控微观世界条件下评估病毒浓度、pH和TOC对病毒吸附的影响；（iii）应用优化的工作流程监测受保护淡水生态系统中的病毒污染。
**二、主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：被动采样器（PS）由硝化纤维素膜（NC）和尼龙膜（NY）构成，部署周期为10天；比较四种核酸提取方案，其中最优方案为QIAamp Viral RNA Mini Kit结合三膜合并提取（方法B）；采用微观世界（microcosm）受控实验评估病毒浓度、pH和TOC对病毒吸附的影响；应用（RT）qPCR和（RT）dPCR进行病毒定量检测；通过巢式RT-PCR（（RT）nPCR）和Sanger测序对HEV阳性样本进行基因分型。现场验证在Montseny自然公园（加泰罗尼亚）两条受保护河流进行，共开展四次采样活动，同时监测粪便指示菌（大肠杆菌和肠道肠球菌）以评估水质。
**三、主要研究结果**
**3.1 被动采样器核酸提取方法的比较**
研究人员以HAdV、RoV-A和HEV为靶标评估了四种核酸提取方法的性能。方法B（QIAamp Viral RNA Mini Kit结合三膜合并提取）获得的HAdV浓度显著高于单膜提取（方法A）（p<0.05），表明合并膜增加了病毒投入量并改善了定量效果。RoV-A仅通过方法B和方法D检出，检出频率分别为1/9和4/9。HEV在所有方法中均呈低水平检出。总体而言，方法B对所有三种靶标的检出表现最为均衡，且在HAdV定量中获得了最高值，支持其用于被动采样中低丰度靶标的检测。
**3.2 微观世界实验：环境因素对病毒吸附的影响**
病毒浓度实验显示，RoV-A在所有浓度条件下均可检出，定量值约为1至2 log基因组拷贝/膜（GC/mbr），但未观察到明显的浓度依赖性增加，表明在此条件下被动采样器更多发挥定性而非定量工具的作用。pH实验表明，HAdV和RoV-A在整个测试pH范围（6.5–8.5）内均可检出，两种病毒的定量值均在pH 7.5时达到峰值；碱性条件下定量值下降，归因于病毒和膜表面均获得更强的负电荷而增强静电排斥。TOC实验显示，RoV-A对有机物变化相对不敏感，而HAdV呈现非线性响应：从中等TOC条件到高TOC条件，检出频率从77.8%和66.7%下降至33.3%，表明适度有机物可能增强吸附，而高TOC可能减少定量、抑制扩增或两者兼有。
**3.3 被动采样器在自然地表水中的野外性能**
在Montseny自然公园两个河流位点的四次采样活动中，粪便指示菌（FIB）在所有样本中均可检出，表明尽管该区域具有保护地位但存在持续的粪便输入。根据欧盟指令2006/7/EC，位点1在前两次事件中水质分类为“优良”，第三次为“良好”；位点2在四次事件中分别分类为“良好”或“优良”。PMMoV作为内参过程对照在所有采样事件中均稳定检出，证实采样器在部署期间正确定位并完全功能。HAdV在位点1仅检出一次，RoV-A在所有样本中均未检出。相比之下，HEV在两个位点均呈间歇性检出，值得注意的是，其检出时期包括了被传统粪便指示菌标准分类为“优良”水质的事件。HEV仅通过（RT）dPCR检出，所有对应的（RT）qPCR反应均未产生扩增信号，确认了数字PCR在检测低丰度病毒颗粒时具有更高的灵敏度和更优的抑制物耐受性。序列分析鉴定这些毒株为HEV基因3型（HEV-3），与GenBank登录号EU495148.1具有高度相似性（同一性98.44%和97.54%）。
**四、讨论与结论**
本研究的发现进一步支持了被动采样器在不同水生环境中进行病毒监测的应用价值。与传统瞬时采样相比，其主要优势在于可时间整合地捕获污染信号，提高检出间歇性病毒输入的概率。然而，研究也表明被动采样器的性能不仅取决于部署策略，还受核酸提取方法选择和分子检测平台等因素影响，并受环境条件对病毒吸附过程的调控。
研究结果揭示了若干有待解决的问题：提取工作流程和报告单位的标准化仍较有限，阻碍了不同研究间的直接比较；需进一步研究不同环境条件下病毒吸附动力学，并建立水体中病毒浓度与被动采样器回收量之间的关系。解决这些方法学缺口将促进被动采样器在一体健康环境监测中的更广泛应用。
研究结论指出：被动采样器为低人为干扰地表水中粪便和人畜共患病毒污染的检测提供了一种非侵入性和时间整合的方法。方法学优化确定了核酸提取是性能的关键决定因素，膜合并可改善病毒定量；微观世界实验表明以pH为主要控制因子的吸附过程主导采样器效率。在受保护河流流域的现场应用证实，被动采样器能够在细菌指示物分类为良好或优良的条件下检出间歇性病毒污染。戊型肝炎病毒基因3型的检出和测序提供了人畜共患病毒输入的直接证据，而这类输入在常规监测中不会被发现。这些发现揭示了细菌指示物与病毒污染之间的关键不匹配，表明仅依赖现行标准可能低估低人为干扰环境中病毒暴露的风险。被动采样器结合灵敏分子工具有望补充现有水质评估框架，但还需在更广泛的空间和时间尺度上进行验证，并开展感染性和风险评估研究，以充分确立其在环境监测和公共卫生保护中的作用。
