发酵鱼酱（Kapi-pla）调节肠道菌群与代谢谱改善阿尔茨海默病（AD）样小鼠认知功能及微生物-肠-脑轴机制研究

《Journal of Agriculture and Food Research》：Fermented fish paste (Kapi-pla) modulates gut microbiota and metabolic profiles to improve cognitive function in an Alzheimer’s disease (AD)-like mouse model

　　

本研究旨在探究传统发酵鱼酱（Kapi-pla）补充是否能够调节氯化铝（AlCl₃）/D-半乳糖诱导的阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）样小鼠模型中的肠道菌群组成与粪便代谢组谱。研究人员采用16S rRNA基因测序分析肠道微生物群落结构，利用气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）定量短链脂肪酸（SCFAs）和支链脂肪酸（BCFAs），并通过超高效液相色谱-高分辨串联质谱（UHPLC-HRMS/MS）进行非靶向代谢组学分析，同时结合旷场实验（OFT）、Y迷宫、新物体识别（NOR）测试及海马组织苏木精-伊红（H&E）染色评估行为学和神经病理学变化。结果表明，300 mg/kg体重的Kapi-pla干预可富集有益微生物类群，包括Lachnospiraceae_NK4A136、Ruminococcus和Akkermansia，显著提高粪便中丙酸、丁酸及异戊酸等SCFAs和BCFAs水平，并调节丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及硫胺素代谢等关键代谢通路。行为学评估显示，Kapi-pla处理组小鼠焦虑样行为减少，Y迷宫新臂探索和NOR辨别指数（DI）显著改善；组织学检查进一步证实海马CA3区和齿状回（DG）神经元丢失减轻。上述结果表明，Kapi-pla具有通过调节微生物-肠-脑轴（microbiota–gut–brain axis, GBA）发挥神经保护作用的潜力，为传统蛋白富集型发酵食品在神经退行性疾病预防策略中的应用提供了新的科学依据。

**研究背景与意义**

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种以β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）沉积、tau蛋白病理改变、突触功能障碍和认知衰退为特征的进行性神经退行性疾病。近年来，肠道菌群通过微生物-肠-脑轴（microbiota–gut–brain axis, GBA）——连接中枢神经系统（central nervous system, CNS）、肠神经系统（enteric nervous system, ENS）和胃肠道（gastrointestinal tract, GI）的双向通讯网络——在神经炎症和神经退行性变中的调节作用日益受到关注。肠道菌群失调（gut dysbiosis）和肠道通透性增加与全身性炎症、血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）破坏及小胶质细胞激活密切相关。发酵食品富含生物活性肽、游离氨基酸和脂肪酸等成分，可能通过调节肠道屏障完整性和黏膜免疫影响宿主生理功能。然而，传统发酵鱼酱（Kapi-pla）——一种在东南亚广泛消费的淡水鱼发酵调味品——对肠道菌群和菌群介导的代谢途径的影响尚缺乏充分研究。因此，研究人员开展了此项研究，以探究Kapi-pla补充能否调节AD样小鼠模型中的肠道菌群组成和粪便代谢组谱，并评估其与认知功能和神经保护效应的关联，为揭示该传统发酵食品在调节GBA中的潜在作用提供依据。

**主要技术方法概述**

本研究采用AlCl₃（200 mg/kg体重，灌胃）联合D-半乳糖（120 mg/kg体重，腹腔注射）持续63天诱导AD样小鼠模型，选用8周龄雄性C57BL/6小鼠共50只，随机分为对照组（CT）、AD模型组（AD+DW）、阳性对照组（AD+Don，多奈哌齐1 mg/kg）、低剂量Kapi-pla组（AD+150PK，150 mg/kg）和高剂量Kapi-pla组（AD+300PK，300 mg/kg），每组10只，干预自第5周开始持续35天。核心技术方法包括：体外模拟胃肠道消化结合液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）对未消化肽进行测序和生物活性预测（PEAKS Studio软件及PeptideRanker评分）；基于16S rRNA基因V3–V4区的下一代测序（NGS）结合QIIME2和PICRUSt2进行肠道菌群分类与功能预测分析；GC-FID定量粪便SCFAs和BCFAs；UHPLC-HRMS/MS非靶向代谢组学结合XCMS软件和KEGG数据库进行差异代谢物筛选与通路富集分析；旷场实验（OFT）、Y迷宫和新物体识别（NOR）测试评估行为学表现；H&E染色评估海马神经元形态与数量。

**主要研究结果**

**3.1 模拟消化后Kapi-pla的预测生物活性肽**

经体外模拟上消化道消化后，共鉴定出10条未消化肽序列，包括ALWQR、FPKFLR、NSLLWLR、LPGSLLLR、NMVWFR、FKDLWQYFK和WNSLLRL等，PeptideRanker评分均高于0.5，提示具有较高的预测生物活性。这些肽被预测具有血管紧张素转化酶（ACE）抑制、抗氧化、二肽基肽酶（DPP）III/IV抑制、肾素抑制和神经保护等多种活性，其中FPKFLR等富含精氨酸的阳离子肽与具有多模态神经保护特性的阳离子富含精氨酸肽（CARPs）相似。

**3.2 Kapi-pla对AD样小鼠肠道菌群的影响**

菌群分析显示，AD样模型诱导期各组的独有扩增子序列变体（amplicon sequence variant, ASV）数量较基线均出现下降，诱导后出现以Bacillota门、Bacteroidota门和Verrucomicrobiota门成员相对丰度降低为特征的菌群失调。干预后，AD+300PK组的总菌群数量降幅最小（9.0%），且该组中Lachnospiraceae_NK4A136和Ruminococcus（属于Bacillota门）以及Akkermansia（属于Verrucomicrobiota门）的z-score标准化丰度在各组中最高（分别为2.07和1.06），提示Kapi-pla可能促进有益丁酸产生菌的富集。α多样性分析显示，300PK组干预后Shannon、Chao1和Simpson指数呈上升趋势（未达统计学显著性，p > 0.05）；β多样性加权UniFrac距离分析结合PERMANOVA检验表明，诱导后各组群落结构存在显著差异（pseudo-F = 4.26, R² = 0.46, p < 0.001），但干预后组间差异不显著（pseudo-F = 1.14, p = 0.33）。

**3.3 SCFAs和BCFAs的产生**

SCFAs分析显示，乙酸为最主要的代谢物，AD+150PK组（31.32 mM）和CT组（27.69 mM）的乙酸浓度显著高于AD+DW组（19.05 mM, p < 0.05）；丙酸和丁酸浓度以AD+300PK组最高。在BCFAs方面，AD+300PK组的异戊酸（11.65 mM）和戊酸（11.71 mM）浓度均显著高于AD+150PK组（p < 0.05）。Spearman秩相关分析揭示了三组显著正相关关系（p < 0.05）：Akkermansia丰度与丙酸水平（r = 0.90）、Ruminococcus丰度与丁酸水平（r = 0.90）、Lachnospiraceae_NK4A136丰度与异戊酸水平（r = 0.90）均呈显著正相关。

**3.4 Kapi-pla补充后AD样小鼠的代谢组通路变化**

非靶向代谢组学分析显示，与AD+DW组相比，AD+300PK组共有249种差异代谢物（150种上调，99种下调）。KEGG通路富集分析表明，AD+300PK组相对于AD+DW组显著影响（p < 0.05）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、硫胺素代谢、精氨酸生物合成、辅因子生物合成、嘧啶代谢和氨酰-tRNA生物合成等通路；相对于CT组，还富集了嘌呤代谢、磷酸转移酶系统（phosphotransferase system, PTS）、β-丙氨酸代谢和磷酸戊糖途径等通路。代表性差异代谢物包括胸腺嘧啶、β-丙氨酸甲酯和谷氨酸γ-甲酯，其浓度在各处理组间呈现显著差异（p < 0.05）。

**3.5 旷场实验行为学评估**

旷场实验结果显示，AD+DW组和AD+150PK组的总运动距离和中心区域停留时间均显著低于CT组（p < 0.05），表明AD样模型诱导了焦虑样行为。而AD+300PK组和AD+Don组在中心区域的停留时间呈增加趋势，提示Kapi-pla干预可能减轻焦虑样行为，这一变化与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路及β-丙氨酸代谢物的富集一致。

**3.6 Y迷宫和NOR测试认知功能评估**

Y迷宫测试中，AD+DW组的新臂进入次数和新臂偏好百分比均显著低于CT组和AD+300PK组（p < 0.05）。在NOR测试中，AD+DW组的辨别指数（discrimination index, DI）显著低于CT组，而AD+300PK组的DI显著高于AD+DW组（p < 0.05），表明高剂量Kapi-pla补充可改善短期空间识别记忆和长期物体识别记忆。

**3.7 海马组织学检查**

H&E染色显示，AD+DW组海马CA3区神经元呈现不规则形态、核固缩深染和细胞间隙增宽，而AD+300PK组神经元形态相对正常，细胞间隙较窄。齿状回（dentate gyrus, DG）中，AD+300PK组健康神经元数量（79.3）显著高于AD+150PK组（26.5, p < 0.05）；CA1–2区中，AD+Don组（80.2）健康细胞数显著高于AD+DW组（33.0）和AD+300PK组（29.0, p < 0.05）；CA3区各组间无显著差异。

**讨论总结与研究结论**

总体而言，本研究结果表明，Kapi-pla补充可调节AD样小鼠模型的肠道菌群-代谢物谱，并与神经保护效应相关联。300 mg/kg体重剂量产生了最显著的反应，表现为有益微生物类群（Lachnospiraceae_NK4A136、Ruminococcus和Akkermansia）的富集、SCFAs和BCFAs水平升高、氨基酸相关代谢通路（尤其是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及β-丙氨酸代谢）的调节，以及焦虑样行为减少、认知功能改善和海马神经元丢失减轻。这些发现提示Kapi-pla作为一种潜在的功能性食品，能够通过调节微生物-肠-脑轴发挥作用，为蛋白富集型发酵食品在减缓神经退行性过程中的应用提供了新的见解。然而，研究人员也指出本研究存在若干局限性：结果来自小鼠模型，外推至人群需进一步验证；微生物和代谢物分析与神经保护效应之间的直接因果关系尚待阐明；缺乏健康小鼠+PK对照组限制了区分疾病特异性恢复与普适性膳食效应的能力；由于Kapi-pla以完整匀浆形式给药，且高剂量伴随更高盐分摄入，无法将观察效应单独归因于生物活性肽。未来研究应纳入Aβ斑块沉积和tau蛋白过度磷酸化的直接病理学评估，增设健康动物对照组，并采用生物活性导向的组分分离策略，以深入解析Kapi-pla各成分对肠-脑轴调节的具体贡献。本研究结论为：发酵鱼酱（Kapi-pla）补充可调节肠道菌群-代谢物谱，并在AD样小鼠模型中伴随神经保护效应，其中300 mg/kg体重剂量效果最为显著，特征为有益菌群富集、SCFAs和BCFAs浓度升高、氨基酸相关代谢通路调节，以及焦虑样行为减少、认知功能改善和海马神经元丢失减轻，提示该传统发酵食品具有通过调节微生物-肠-脑轴参与神经退行性疾病预防策略的潜力。