《Journal of Agriculture and Food Research》：Probiotic associated traits and genomic insights of
Companilactobacillus farinae sp. nov. from Thai fermented rice flour for potential poultry application
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全球对替代抗菌剂的需求日益增长，这主要源于消费者对促进健康与福祉产品的兴趣，以及人类对抗菌药物耐药性出现的关注。此外，食用受药物残留污染的动物产品加剧了人类群体中抗菌药物耐药性的流行。因此，人们日益重视减少牲畜生产中抗菌药物和生长促进剂的
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全球对替代抗菌剂的需求日益增长，这主要源于消费者对促进健康与福祉产品的兴趣，以及人类对抗菌药物耐药性出现的关注。此外，食用受药物残留污染的动物产品加剧了人类群体中抗菌药物耐药性的流行。因此，人们日益重视减少牲畜生产中抗菌药物和生长促进剂的过度使用，以避免药物残留进入环境和食物链。益生菌作为抗菌药物的有效替代品，主要发挥预防而非治疗作用。虽然多种益生菌株属于具有安全使用历史的乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）物种，但通过鉴定具有更强健壮性和功能特性的新菌株来扩大益生菌多样性至关重要。新益生菌的开发涉及多个环节，始于特定细菌菌株的鉴定；候选益生菌提出后，需对其安全性和功能特性进行评估，包括在胃肠道条件下的存活能力和对肠黏膜的黏附能力。为补充这些表型测定，全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）已成为预测益生菌相关特性的有效方法，为观察到的功能特性提供全面的遗传学基础。
发酵食品是乳酸菌的丰富来源；然而，来自泰国传统发酵产品的新菌株的系统性表征仍存在显著的研究空白，这些产品中的微生物通常适应当地生态位。khao-khab（一种泰国传统发酵米粉制品）的天然发酵过程包括浸泡大米、蒸制和晒干成薄片，通常作为面条卷或脆饼食用。作为一种发酵产品，khao-khab创造了低pH和高淀粉含量的选择性环境。分布于该制品中的乳酸菌在降低pH、改善质构和保存产品方面发挥作用。Companilactobacillus属最近从Lactobacillus属重新分类而来，以更好地归类这些具有相似代谢特性和通常与食品发酵相关的生态位的细菌。
鉴于其生态位，该属的细菌菌株在食品工业中具有多方面潜在应用，如多功能发酵剂、天然生物防腐剂和益生菌候选菌株。虽然已有多种Companilactobacillus物种从发酵食品和青贮饲料中被评估和鉴定，但分离自淀粉基发酵生态位的物种在很大程度上仍未得到探索。此外，既往研究表明Companilactobacillus物种具有显著的益生特性，特别是其对肠道条件的耐受性、抗菌活性和免疫调节活性。研究人员假设khao-khab的环境支持具有独特益生潜力的新型乳酸菌物种的生长。因此，本研究旨在从khao-khab中鉴定和表征一种新的细菌物种，并通过整合多相分类学、体外实验（in vitro assays）和比较基因组学（in silico comparative genomics）评估其作为家畜饲料添加剂的适宜性。本研究结果提供了一种从发酵食品中发现有前景的益生菌候选菌株的综合方法，可作为传统益生菌菌株的替代方案。
### 论文解读文章
#### 研究背景与科学问题
全球范围内抗菌药物耐药性的蔓延对人类健康构成严重威胁，而畜牧业中抗菌药物和生长促进剂的滥用加剧了这一危机。动物产品中残留的药物通过食物链传递给人类，推动耐药基因的传播。因此，寻找安全有效的抗菌替代品成为当务之急。益生菌因其预防性功能而被视为理想替代方案，主要发挥预防而非治疗作用。虽然已有多种乳酸菌被广泛应用，但为满足日益增长的多样化需求，仍需从特殊生态位中发掘具有增强健壮性和独特功能特性的新型菌株。
发酵食品是乳酸菌的重要来源，然而，泰国传统发酵产品中微生物资源的系统性挖掘仍显不足。khao-khab是一种泰国传统发酵米粉制品，其制备过程涉及浸泡、蒸制和日晒，形成了低pH和高淀粉的独特选择性环境。该环境中的乳酸菌不仅参与酸化过程，还改善产品质构并发挥保藏作用。Companilactobacillus属是近年来从Lactobacillus属重新分类而来的新属，成员多与食品发酵相关。尽管已有多种该属物种从发酵食品中被鉴定，但来自淀粉基发酵生态位的物种研究仍属空白。此前研究提示该属物种具备显著益生潜力，如肠道耐受性和病原菌抑制能力。基于上述背景，研究人员提出科学假说：khao-khab的特殊环境支持具有独特益生特性的新种乳酸菌的生长。本研究旨在通过整合多相分类学、体外功能评估和比较基因组学，从该传统发酵食品中分离并系统表征潜在益生菌新种，评估其作为家禽饲料添加剂的可行性。
#### 研究目标与主要方法
研究人员从泰国程逸府拉普叻县采集10份khao-khab样品，通过常规稀释平板法在含碳酸钙的MRS培养基上分离产酸菌落，获得疑似乳酸菌菌株FL22-1?和FL22-3。菌株由Somboon Tanasupawat于2012年12月分离纯化并冻干保藏。研究采用多相分类策略，包括形态学与生理生化特征分析、化学分类学分析（细胞壁肽聚糖组成、极性脂质谱和细胞脂肪酸谱）、16S rRNA基因系统发育分析、全基因组测序与平均核苷酸一致性（ANI）及数字DNA-DNA杂交（dDDH）计算。功能基因注释借助RAST平台完成；益生特性预测基于与模式益生菌Lactobacillus rhamnosus GG（LGG）的比较基因组学。安全性评估整合了ResFinder、CARD、PathogenFinder和PlasmidFinder等数据库分析。体外实验涵盖耐酸耐胆盐试验、Caco-2与HT-29细胞黏附试验、模拟家禽胃肠道存活试验、抗生素敏感性试验、DPPH与ABTS自由基清除能力测定、短链脂肪酸及乳酸产量检测、病原菌抑制试验以及基于THP-1来源巨噬细胞的免疫调节试验。
#### 研究结果
**3.1 乳酸菌分离**：研究人员从khao-khab样品中分离获得两株在MRS-碳酸钙平板上产生透明溶钙圈的革兰氏阳性杆菌，初步判定为疑似乳酸菌，命名为FL22-1?和FL22-3。
**3.2 表型与化学分类学特征**：两菌株均为革兰氏阳性、无运动性、兼性厌氧杆菌，大小约0.45–0.52 μm × 0.78–1.75 μm。菌落在MRS平板上呈白色、圆形、凸起、边缘整齐，直径1.0–1.5 mm。生长温度范围15–40°C，pH范围3.5–7.0，耐NaCl浓度最高7%（w/v）。触酶、氧化酶、产气、七叶灵水解和硝酸盐还原试验均为阴性。主要发酵产物为DL-乳酸。可发酵D-纤维二糖、D-半乳糖、D-乳糖等碳水化合物，不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露醇和D-核糖。酶学活性检测显示亮氨酸芳基酰胺酶和β-葡萄糖苷酶阳性。化学分类学分析显示，主要脂肪酸为C18:1 ω9c（32.12%/34.14%）、Summed feature 7（29.0%/28.4%）和C16:0（17.1%/16.3%）；极性脂质含磷脂酰甘油（PG）、双磷脂酰甘油（DPG）及三种未鉴定糖脂（GL1–GL3）；细胞壁肽聚糖含赖氨酸和天冬氨酸，符合Companilactobacillus属特征。
**3.3 16S rRNA基因系统发育分析**：FL22-1?（LC876918，1349 bp）与C. nantensis JCM 16171?相似性最高（98.96%），FL22-3（LC878507，1385 bp）与C. nantensis JCM 16171?相似性为99.28%。基于邻接法（NJ）、最小进化法（ME）和最大似然法（ML）构建的系统发育树均支持两菌株形成独立分支，与相近模式菌株明显区分，自举值分别为85%、94%和95%。
**3.4 基因组特征与物种命名**：FL22-1?基因组大小为2.55 Mb（2,545,401 bp），G+C含量37.5 mol%，N50为197,541 bp，包含46个重叠群，基因组完整度99.48%，污染率2.09%。FL22-3基因组大小2,535,562 bp，G+C含量37.5%。两菌株间ANI为99.89%，dDDH为99.70%，确证为同一物种。与已知相近物种比较，ANI值介于77.93%–79.20%，dDDH值介于22.70%–24.80%，均低于物种界定阈值（ANI < 95%，dDDH < 70%）。据此，两株菌被命名为新种Companilactobacillus farinae sp. nov.，模式菌株为FL22-1?（=KCTC 21250? = LMG 33809? = TISTR 10641?）。
**3.5 比较基因组分析与功能基因预测**：与商业益生菌LGG比较，FL22-1?的病原菌概率（0.229）与LGG（0.198）相近，均判定为非人类病原菌。基因组中检出来自qacG、qacJ和vanG簇vanT基因的耐药相关基因，但均不位于可移动质粒元件上。FL22-1?基因组中含酸耐受相关基因gadB（谷氨酸脱羧酶）和arcD（精氨酸/鸟氨酸反向转运体）、胆汁盐外排泵基因bcrR、黏液结合蛋白基因mucBP及黏附相关基因lapA，以及核黄素（ribBA-Z）和叶酸（folA-T）生物合成基因簇和乙酸激酶基因ackA。与LGG共享1321个直系同源基因，并拥有95个特有基因，其中包含特有的Gfo/Idh/MocA家族氧化还原酶基因，该基因在LGG、L. paracasei BL23和L. acidophilus NCFM中均不存在，预测与氧化还原稳态和环境胁迫耐受相关。
**3.6 体外益生特性与安全性评估**：耐酸试验中，pH 2.5处理180 min后，FL22-1?和FL22-3存活率分别为19.95%和20.24%，优于LGG（12.27%）；pH 3.0时存活率分别为65.30%和86.48%。0.3%胆盐处理180 min后，两菌株存活率为34.54%和31.94%，低于LGG（91.84%）。细胞黏附试验显示，两菌株对Caco-2和HT-29细胞的黏附率（0.01%–0.11%）显著低于LGG（1.35%–1.94%）。在模拟家禽胃肠道环境中，FL22-1?在胃期120 min和肠期240 min后的存活率分别为4.57%和2.44%，FL22-3为2.29%和0.99%，对数值减少均低于2.0 log CFU/mL。抗生素敏感性试验显示，两菌株对氨苄西林、氯霉素和克林霉素敏感，对红霉素呈中介，对庆大霉素和万古霉素耐药；但基因组未检出可转移耐药基因。抗氧化活性测定中，FL22-1?和FL22-3的DPPH清除率分别为83.17%和87.20%，均高于LGG（74.69%）；ABTS清除率分别为86.33%和89.00%，FL22-3略低于LGG（91.18%）。代谢产物分析表明，FL22-1?产乳酸107.46 mM，并可合成丙酸（23.20 mM）和己酸（23.50 mM）。两菌株对测试的10株指示菌均无抑菌活性。免疫调节试验中，两菌株的无细胞上清液显著抑制脂多糖（LPS）诱导的IL-6产生（抑制率93.41%和94.91%），热灭活菌体的抑制率较低（29.52%和33.17%）；上清液对TNF-α的抑制率为28.85%和37.56%。
#### 讨论与结论
本研究发现并系统表征了一种新的乳酸菌物种Companilactobacillus farinae，拓展了对淀粉基发酵生态位中乳酸菌多样性的认知。基因组合表型整合分析不仅确立了其分类学地位，还揭示了多项值得关注的益生特性。基因组中存在gadB、arcD和bcrR等与胃肠道耐受相关的基因，与体外耐酸试验结果相符，尤其在pH 2.5条件下其存活率优于模式益生菌LGG。特有的氧化还原酶基因家族预测赋予其独特的抗氧化潜能，与较高的DPPH自由基清除活性相互印证。安全性方面，尽管检出部分耐药相关基因和α-溶血活性，但耐药基因均非位于可移动元件上，且缺乏已知毒力因子，综合评估显示其具备候选益生菌的基本安全特征。上清液显著的抗炎活性提示该菌株具有开发为后生元（postbiotics）的潜力。值得注意的是，体外黏附率偏低和模拟胃肠道存活率有待提升，提示实际应用中需保证足够高的接种剂量（10?–10? CFU/mL）以维持有效活菌数，且家禽肠道环境的复杂性需通过进一步的体内研究加以验证。
结论部分指出：本研究将菌株FL22-1?和FL22-3鉴定为新种Companilactobacillus farinae sp. nov.，该菌种展现出应用于家禽饲料的有前景的益生特性。整合的体外（in vitro）和计算机模拟（in silico）评估证明了其强大的胃肠道耐受性，这由模拟家禽胃肠道条件下的良好存活能力所支持。比较基因组分析揭示了其与已确立益生菌间的高度代谢基因共享，而特定氧化还原酶编码基因的存在则提示其适应环境胁迫的能力。通过整合表型测定与基因组学见解，本研究提出C. farinae FL22-1?是一个安全的新型益生菌候选菌株。这些发现为开发可持续功能性食品和创新动物饲料补充剂提供了宝贵的微生物资源，可作为传统益生菌菌株的有力替代方案。
