多组学整合分析揭示三羧酸循环与线粒体代谢重塑在黄芪甲苷IV心脏保护中的作用机制

《Journal of Agriculture and Food Research》：Multi-omics Analysis Reveals TCA Cycle and Mitochondrial Metabolic Remodeling Associated with Astragaloside IV-Mediated Cardioprotection

　　

研究人员通过整合多组学分析策略，探究了铜死亡（Cuproptosis）相关细胞死亡功能障碍与线粒体代谢在糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy, DCM）中的作用。通过整合转录组学（Transcriptomics）、靶向代谢组学（Targeted Metabolomics）、生物信息学（Bioinformatics）和分子对接（Molecular Docking）技术以阐明作用机制，研究人员证实黄芪甲苷IV（Astragaloside IV, ASIV）通过调控三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle, TCA Cycle）中间产物DL-苹果酸（DL-malate）减轻高糖诱导的AC16人心肌细胞损伤。分子对接结果显示，黄芪甲苷IV与PDHA1（丙酮酸脱氢酶复合体E1α亚基）具有较强的结合亲和力；作为DCM的潜在治疗靶点，PDHA1可通过直接相互作用稳定线粒体功能。研究人员提出铜死亡-TCA循环轴可作为基于天然产物疗法的DCM治疗新靶点。

**研究背景**

2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM）是全球重大公共卫生挑战，糖尿病相关心血管疾病是患者死亡的首要原因。糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy, DCM）是一种在排除冠状动脉疾病和高血压情况下以心室功能障碍为特征的独特疾病，最终可进展为心力衰竭。DCM发病机制涉及代谢紊乱、慢性炎症、氧化应激和纤维化等多因素交互作用。高糖环境下心肌细胞耗氧量异常升高，导致活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）过度积累，引发线粒体结构损伤和心脏收缩功能受损；线粒体呼吸链复合物功能障碍进一步造成电子泄漏和超氧化物生成，加剧线粒体损伤，推动DCM进展。目前临床药物策略主要聚焦于血糖控制、改善心肌重构和缓解心力衰竭，但部分药物的心脏保护机制——尤其是在改善线粒体和代谢功能障碍方面——仍不完全清楚。铜死亡（Cuproptosis）是一种新近报道的与线粒体呼吸代谢和TCA循环活性密切相关的调控性细胞死亡形式，其相关基因集可作为探索性生物信息学筛选框架，但既往研究尚未将其与天然产物干预DCM的代谢调控网络进行系统关联。黄芪甲苷IV（Astragaloside IV, ASIV）是中药黄芪（Astragalus membranaceus）的主要生物活性皂苷成分，已在糖尿病肾病和心肌病临床前模型中显示出抗氧化、抗炎和抗凋亡活性，然而ASIV保护心肌细胞免于糖尿病损伤的具体分子和代谢变化机制尚未完全阐明。为填补上述研究空白，研究人员采用整合多组学策略，系统表征ASIV干预对高糖诱导AC16人心肌细胞的分子和代谢调控效应。

**关键技术方法**

本研究以人源AC16心肌细胞系（Procell, CL-0790）为实验对象，采用33 mM高糖建立DCM细胞模型，以10 μM ASIV进行干预。转录组分析采用Illumina平台双端150 bp RNA测序，使用DESeq2进行差异表达分析（筛选标准：|log₂(FC)| > 0.6，校正P < 0.05），通过DAVID平台进行GO和KEGG功能富集分析。靶向代谢组学采用超高效液相色谱-质谱联用系统（Thermo Vanquish UHPLC联用Orbitrap Exploris 120质谱仪，配备电喷雾离子源ESI），在正、负离子模式下分别进行代谢物检测。核心基因和代谢物的筛选采用随机森林（Random Forest）、支持向量机（SVM）等机器学习算法。分子对接通过CB-Dock2平台以盲对接模式评估化合物与靶蛋白的结合亲和力，以结合能≤?5.0 kcal/mol作为高亲和力阈值。

**主要研究结果**

**ASIV恢复高糖损伤AC16心肌细胞的活力**：CCK-8实验结果显示，10 μM和20 μM ASIV处理24小时后AC16细胞存活率较高糖处理组显著升高（10 μM组P < 0.0001），且10 μM浓度对正常细胞无显著毒性，故后续实验均采用10 μM为干预浓度。显微镜观察和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测进一步证实ASIV可恢复细胞正常形态并显著降低高糖诱导的细胞凋亡率。

**ASIV逆转糖尿病心肌细胞损伤中的转录组失调**：RNA测序分析显示，模型组（高糖，Mod）与对照组（Con）相比共鉴定出2,983个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），其中2,182个上调、801个下调；ASIV组与Mod组比较鉴定出2,908个DEGs（768个上调、2,140个下调）；而ASIV组与Con组之间仅检测到596个DEGs，表明ASIV可在转录组层面显著逆转高糖诱导的基因表达异常。主成分分析（PCA）显示三组样本呈现明显分离，ASIV组聚类位置介于Con组与Mod组之间。

**候选基因的识别与优先排序**：研究人员通过将铜死亡相关基因集（来源于OMIM和GeneCards数据库及文献报道）与Mod vs Con差异基因、ASIV vs Mod差异基因进行交集分析，共获得19个核心候选基因。采用七种机器学习算法评估后，基于随机森林模型的变量选择筛选出8个最优候选基因，其中PDHA1、SLC25A3、VEGFA、SERPINE1和CDKN2A具有较高的平均递减基尼系数特征重要性。需强调的是，铜死亡基因集仅作为生物信息学筛选框架，不应被解读为实验中发生了铜诱导细胞死亡的直接证据。

**候选基因的功能分析**：GO富集分析显示核心基因参与缺氧应答、丙酮酸转化为乙酰辅酶A、核酸酶活性调控等生物学过程（Biological Process, BP），定位于线粒体外膜、RNA聚合酶II转录调控复合物等细胞组分（Cellular Component, CC），具有蛋白酶结合、蛋白激酶B结合和氧化还原酶活性等分子功能（Molecular Function, MF）。KEGG通路分析表明PDHA1主要与α-硫辛酸代谢和TCA循环相关，SERPINE1富集于细胞衰老、Hippo信号通路和HIF-1信号通路，MYC广泛涉及细胞周期、AGE-RAGE信号通路、p53信号通路和PI3K-Akt信号通路等。

**表达谱分析与蛋白互作网络表征**：Z-score标准化表达聚类热图显示ASIV组表达模式向Con组回归，与整体转录组变化趋势一致。蛋白-蛋白互作（Protein-Protein Interaction, PPI）网络分析显示8个核心蛋白节点间存在关联网络。重复测量单因素方差分析证实ASIV处理可部分逆转高糖诱导的基因表达上调趋势。

**代谢组学分析揭示ASIV诱导的代谢转变**：靶向代谢组学质控评估显示混合质控样本中绝大多数代谢物变异系数（Coefficient of Variation, CV）低于20%，表明分析平台具有高重现性。非监督PCA和监督OPLS-DA分析（正离子模式：R²Y = 0.996，Q² = 0.991；负离子模式：R²Y = 0.994，Q² = 0.951）均证实三组间代谢谱存在显著分离，ASIV组代谢谱向Con组部分回归。

**TCA循环相关代谢物的评估**：靶向代谢组学共检出6种TCA循环代谢物，包括琥珀酸、异柠檬酸、草酰乙酸、DL-苹果酸、乌头酸和富马酸，其丰度在不同处理组间呈现异质性变化。ASIV干预后DL-苹果酸和富马酸水平显著升高，而异柠檬酸和草酰乙酸水平降低，提示TCA循环内发生了选择性代谢重组而非整体恢复。

**监督建模与多组学整合分析**：通过将Mod vs Con和ASIV vs Mod的差异代谢物取交集，获得37个被ASIV逆转的代谢物。随机森林和SVM两种机器学习方法整合筛选出5个ASIV相关核心代谢物：2′-脱氧腺苷5′-单磷酸、胞苷3′-单磷酸、肾上腺素、氧化型谷胱甘肽和DL-苹果酸。Spearman相关性分析显示SLC25A3、BCL10和PDHA1与变肾上腺素呈强正相关，而除BCL10外的大多数核心基因与DL-苹果酸呈显著负相关。典型相关分析（Canonical Correlation Analysis, CCA）显示第一和第二典型变量对的相关系数分别为0.985和0.931，表明转录组与代谢组数据集之间存在强线性关联。通路富集分析以TCA循环和丙酮酸代谢为最显著富集通路。分子对接结果表明ASIV与PDHA1的结合能为?8.3 kcal/mol，DL-苹果酸与PDHA1的结合能为?6.1 kcal/mol，均远低于?5.0 kcal/mol的高亲和力阈值。

**讨论与结论**

本研究通过整合多组学分析策略系统揭示了ASIV对高糖诱导AC16心肌细胞的代谢调控效应。在转录水平，PDHA1被识别为与丙酮酸代谢和TCA循环功能相关的候选调控节点，高糖刺激下PDHA1表达显著上调可能反映心肌细胞对底物利用改变的代偿性应答，ASIV干预后其表达部分回落。在代谢水平，DL-苹果酸在ASIV干预后显著升高，提示TCA循环相关代谢平衡的部分恢复。PDHA1表达与DL-苹果酸丰度之间的显著负相关性提示二者在转录-代谢重塑过程中可能存在协同变化，但相关性分析不能直接建立因果调控关系。分子对接虽显示ASIV与PDHA1具有良好的结构相容性，但ASIV是否直接结合PDHA1或影响丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate Dehydrogenase Complex, PDC）活性仍需通过表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）、细胞热转变分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）及酶活性检测等生化实验进一步验证。此外，本研究局限于AC16人心肌细胞体外模型，尚不能完全反映DCM的系统性代谢和血管异常，后续将采用db/db小鼠模型评估ASIV的整体心脏保护效应及体内分子调控机制。研究结论指出：ASIV可部分逆转高糖诱导的AC16心肌细胞转录和代谢紊乱，特别是涉及丙酮酸代谢、TCA循环和线粒体能量代谢通路；调节线粒体代谢稳态和TCA循环相关代谢重塑可能是ASIV发挥糖尿病心肌细胞保护作用的重要机制，PDHA1可作为ASIV心脏保护效应的候选代谢调控节点。