血清AGRN和ADAMTS8对颈动脉斑块存在与易损性的诊断效能评估：一项健康对照设计中的谱偏倚警示

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Circulating Serum AGRN and ADAMTS8 With Related Candidates as Potential Biomarkers for Carotid Plaque Presence and Vulnerability

　　

背景：颈动脉粥样硬化是缺血性卒中的主要病因基础。尽管影像学手段可以评估狭窄程度和斑块形态特征，但循环生物标志物可能更有利于开展大规模筛查和风险分层；然而，能够可靠反映颈动脉斑块存在尤其是斑块不稳定性的血清蛋白标志物仍然十分有限。

方法：研究人员共纳入128名参与者，包括稳定性斑块患者（n=41）、不稳定性斑块患者（n=49）和健康对照（n=38）。斑块稳定性通过颈动脉超声检查判定。研究人员预先设定了一个包含七种蛋白的血清生物标志物组合并全部进行了检测：集聚蛋白（agrin, AGRN）、含血小板反应蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶8（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 8, ADAMTS8）、ADAMTS9、XVIII型胶原α1链（collagen type XVIII alpha 1 chain, COL18A1）、整合素β4亚基（integrin subunit beta 4, ITGB4）、赖氨酰氧化酶样蛋白4（lysyl oxidase like 4, LOXL4）和Slit引导配体3（slit guidance ligand 3, SLIT3）。所有蛋白均采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行定量检测。组间比较采用多重比较校正。通过受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）分析和曲线下面积（area under the curve, AUC）评估单个生物标志物以及联合预测概率区分斑块存在和斑块不稳定性的能力。

结果：斑块组与健康对照组之间的基线特征存在显著差异。斑块患者血清AGRN浓度显著高于对照组（均值±标准差，稳定性斑块组：2222.42±508.30 pg/mL；不稳定性斑块组：2109.59±513.51 pg/mL；健康对照组：1800.36±375.89 pg/mL；总体p<0.001），而ADAMTS8水平在各组间无显著差异（总体p=0.110）。在采用log₂转换生物标志物的多变量Firth惩罚logistic回归中，经年龄、性别、高血压、饮酒、血脂异常、吸烟、糖尿病和冠心病等因素校正后，AGRN和ADAMTS8均不与斑块存在或斑块不稳定性独立相关（所有校正后p>0.05）。在区分斑块存在方面，AGRN+ADAMTS8联合模型的表现AUC为0.771（bootstrap 95% CI，0.678–0.865；乐观校正AUC，0.764；重复分层5倍交叉验证AUC，0.749）。对于斑块不稳定性，联合模型未显示出区分能力（表现AUC，0.549；乐观校正AUC，0.498；重复5倍交叉验证AUC，0.471）。

结论：以血清浓度测定的循环AGRN和ADAMTS8与颈动脉斑块存在（相对于健康对照）相关，但在多变量校正后不能独立区分斑块存在或不稳定性。仅临床协变量（年龄、性别、血管危险因素）即可提供近乎完美的斑块存在区分能力，表明健康对照比较设计引入了显著的谱偏倚（spectrum bias）。这些发现强调了未来生物标志物研究中采用年龄和危险因素匹配的对照人群的必要性，这与STARD 2015推荐意见一致。

**论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

颈动脉粥样硬化是缺血性卒中的重要病因基础，也是目前病因学评估和二级预防的关键靶点。现行的血管影像学检查手段——以颈动脉双功能超声（duplex ultrasonography, DUS）为主，辅以CT血管造影（CTA）和磁共振血管造影（MRA）——能够评估狭窄程度和斑块形态特征。除狭窄程度外，斑块溃疡、斑块内出血（intraplaque hemorrhage, IPH）以及富含脂质的坏死核心（lipid-rich necrotic core, LRNC）等不稳定性特征被认为是决定脑血管风险的重要因素。然而，基于影像学的筛查在无症状人群中实施难度较大且成本高昂。循环生物标志物有望支持可扩展的筛查和风险分层，但目前能够可靠反映斑块存在或不稳定性的血清蛋白标志物仍十分匮乏。

细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑在斑块进展和失稳过程中发挥核心作用。蛋白聚糖、金属蛋白酶、基底膜组分以及参与基质交联或细胞-基质粘附的分子可通过影响炎症反应、平滑肌细胞表型转换和纤维帽完整性来调节斑块不稳定性。集聚蛋白（agrin, AGRN）是一种最初在神经肌肉接头中被发现的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，同时也在血管和基底膜结构中表达，可能影响内皮功能和ECM结构。ADAMTS8（含血小板反应蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶8）是一种参与ECM降解和血管重塑的分泌型金属蛋白酶。基于ECM重塑、炎症反应和纤维帽完整性之间的病理生物学关联，研究人员预先设定了一个由七种循环蛋白组成的候选生物标志物组合，旨在捕捉ECM生物学的不同维度，包括基底膜结构（AGRN、ITGB4）、蛋白酶介导的基质周转（ADAMTS8、ADAMTS9）、胶原来源的信号（COL18A1）、基质交联（LOXL4）以及平滑肌细胞迁移（SLIT3）。本研究的目的是在单一人群中检测上述预设生物标志物组合的血清水平，并评估其区分颈动脉斑块患者与健康对照、以及超声定义的不稳定性斑块与稳定性斑块的能力。

**二、研究方法概述**

本研究为横断面对照研究，于2018年至2023年在首都医科大学宣武医院纳入128名18-65岁的参与者，含稳定性斑块患者41例、不稳定性斑块患者49例和健康对照38例。斑块稳定性通过颈动脉超声（B型成像联合彩色多普勒，选用Philips IU-22或Hitachi Aloka Ascendus，5–12 MHz线阵探头）判定，参照Mannheim共识定义斑块，并采用经Geroulakos改良的Gray-Weale分型评估斑块回声特征。不稳定性斑块的超声标准为满足以下至少一项：颈内动脉狭窄≥70%、斑块溃疡（表面缺损深度≥2 mm）和/或低回声或主要低回声斑块结构（Gray-Weale I型或II型）。

血清标本经标准化低温前处理流程采集后分装冻存于?80°C，采用ELISA法对七种预设蛋白进行批量检测：AGRN、ADAMTS8、ADAMTS9、COL18A1、ITGB4、LOXL4和SLIT3。此外，SPARC因在初步实验中低于检测下限而被排除。

统计分析方面，三组间连续变量比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验，分类变量采用χ²检验或Fisher精确检验，事后配对比较采用Bonferroni校正。采用多变量Firth惩罚logistic回归评估AGRN和ADAMTS8在经年龄、性别、高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟、饮酒和冠心病校正后与斑块存在和斑块不稳定性的独立关联，生物标志物浓度经log₂转换后以每翻倍浓度报告比值比（odds ratio, OR）。ROC性能采用bootstrap重采样（1000次）进行乐观校正，并采用重复分层5倍交叉验证（重复100次）进行内部验证。所有分析基于R 4.5.0完成。

**三、主要研究结果**

**3.1 研究人群与基线特征**

128名参与者的基线特征显示，斑块组与健康对照组在年龄、性别构成和血管危险因素方面存在显著差异。健康对照组更年轻（平均年龄50.8岁 vs. 稳定组62.3岁、不稳定组65.1岁）、女性比例更高（65.8% vs. 稳定组9.8%、不稳定组10.2%），且高血压（7.9% vs. 61.0%–69.4%）、糖尿病（0% vs. 29.3%–44.9%）、冠心病（0% vs. 14.6%–24.5%）、吸烟（10.5% vs. 65.3%–73.2%）和饮酒（13.2% vs. 48.8%–57.1%）的发生率均明显更低。

**3.2 血清生物标志物浓度组间比较**

三组间总体比较显示AGRN浓度存在显著差异（p<0.001），而ADAMTS8在三组间总体比较中未见显著差异（p=0.110）。配对比较中，稳定性斑块组（p<0.001）和不稳定性斑块组（p=0.005）的AGRN浓度均显著高于健康对照组，但稳定性与不稳定性斑块组之间无显著差异（p=0.898）。ADAMTS8在不稳定性斑块组中低于健康对照组（p=0.025），但经Bonferroni校正后该差异以及其余配对比较均未达到统计学显著性。其余五种候选生物标志物（ADAMTS9、COL18A1、ITGB4、LOXL4和SLIT3）在总体比较和配对比较中均未显示出显著的组间差异（所有Bonferroni校正后p>0.05）。

**3.3 斑块存在与斑块不稳定性的区分效能**

多变量Firth惩罚logistic回归结果显示，在未经校正的分析中，AGRN与斑块存在呈强关联（OR每翻倍11.90，p<0.001），ADAMTS8则呈反向关联（OR每翻倍0.32，p=0.003）。然而，经年龄、性别、高血压、饮酒、血脂异常、吸烟、糖尿病和冠心病等协变量校正后，两种生物标志物均失去独立显著性（AGRN校正后OR 4.90，p=0.251；ADAMTS8校正后OR 0.66，p=0.427），表明未校正的关联在很大程度上受到年龄和心血管危险因素谱的混杂影响。内部验证显示，联合模型区分斑块存在的表现AUC为0.771（bootstrap 95% CI，0.678–0.865；乐观校正AUC，0.764；重复分层5倍交叉验证AUC，0.749），但对斑块不稳定性未显示出区分能力（表现AUC，0.549；乐观校正AUC，0.498；交叉验证AUC，0.471）。

**四、讨论与结论**

研究人员的核心发现是：血清AGRN和ADAMTS8浓度在颈动脉斑块患者与健康对照之间存在差异，但在多变量校正后不能独立区分斑块存在或不稳定性。未经校正的显著关联在调整后消失，提示这些关联主要由年龄和心血管危险因素谱所驱动。Firth回归中校正后OR的宽置信区间（如AGRN区分斑块vs.健康对照：0.32–73.93）也反映了128名参与者中显著的协变量不平衡所导致的有限精度。

研究人员指出，循环AGRN可能与伴随动脉粥样硬化发生的整体血管壁重塑过程关系更为密切，而非反映特定颈动脉病变内的斑块失稳。ECM重塑是动脉粥样硬化的核心特征，而全身性检测可能优先捕捉整体重塑活动，而非单个斑块的局灶性结构破坏。

本研究的一个重要方法学问题是，因采用健康对照设计而引入了谱偏倚。STARD 2015诊断准确性研究报告指南明确告诫应避免"最病患者对比最健康者"的比较。在本研究中，健康对照组明显更年轻、女性占比较高且心血管危险因素负担极低，因此临床协变量本身即可提供近乎完美的组间区分。由此，联合模型的斑块存在区分效能（AUC 0.771）应谨慎解读。对于斑块不稳定性，模型的区分能力为零或接近零（乐观校正AUC 0.498），表明血清AGRN和ADAMTS8在单次检测的条件下，不能为超声定义的斑块不稳定性提供有临床意义的区分信息。超声定义的斑块不稳定性特征（如溃疡或主要低回声形态）来源于局灶性斑块组成和表面变化，可能无法通过单时间点的外周血蛋白检测得到一致反映。此外，基于Gray-Weale分型的超声不稳定性判读标准已发表的观察者间kappa值为0.31–0.79，且本研究的斑块分类来源于临床超声报告而非专项研究判读，可能存在表型误分类，从而部分削弱观察到的关联。同时，高分辨率颈动脉MRI在本研究期间未能系统性地应用于斑块特征评估。

本研究存在以下局限性：横断面设计无法建立时序关系，样本量（N=128）可能限制统计效能，斑块患者与健康对照之间的显著基线不平衡引入谱偏倚，超声不稳定性分类来源于临床报告而非标准化研究判读且缺乏正式的观察者一致性评估，高分辨率颈动脉MRI未能系统性应用，靶向蛋白组合虽基于ECM生物学但并非来源于无偏倚蛋白质组学发现，生物标志物仅单时间点测量以及Firth惩罚logistic回归在小样本中可能产生较宽置信区间。

**研究结论**（原文翻译）：在这项病例对照研究中，血清AGRN和ADAMTS8浓度在颈动脉斑块患者与健康对照之间存在差异，但经多变量Firth惩罚logistic回归校正后，两种生物标志物均不与斑块存在或斑块不稳定性独立相关。AGRN+ADAMTS8联合模型对斑块存在显示出中等的表观区分能力（AUC 0.771），但对斑块不稳定性几乎无区分能力（AUC 0.549）。斑块患者与健康对照之间显著的协变量不平衡表明存在实质性谱偏倚，且仅临床协变量即可预期提供近乎完美的组间区分。这些发现表明，健康对照比较设计可能高估生物标志物效能，并强调了在未来颈动脉斑块生物标志物的诊断准确性研究中采用疾病特异性、危险因素匹配对照人群的重要性，这与STARD 2015推荐意见一致。