长期氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）胁迫下缺氧–好氧膜生物反应器中微生物群落重构及胞外聚合物响应研究

《Environmental Microbiology Reports》：Microbial Community Restructuring Under Zinc Oxide Nanoparticle Stress in Membrane Bioreactors

　　

氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）越来越多地释放到水环境中，引发了对其在生物废水处理系统中影响的关注。本研究考察了ZnO NPs长期暴露对连续运行144天的浸没式缺氧–好氧膜生物反应器（Membrane Bioreactor, MBR）中微生物群落动态和胞外响应的影响。两个相同的MBR分别在对照条件和ZnO NPs暴露条件（1–50 mg L^?1）下运行。研究人员采用高效液相色谱–尺寸排阻色谱（HPLC–SEC）、荧光激发–发射矩阵（FEEM）光谱和16S核糖体RNA（16S rRNA）测序，评价了反应器性能、胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances, EPS）、可溶性微生物产物（Soluble Microbial Products, SMPs）、分子量（Molecular Weight, MW）分布、荧光特性及细菌群落结构。在50 mg L^?1 ZnO NPs暴露下，氨氮（NH₄⁺–N）去除效率从85.0% ± 2.5%显著降低至65.2% ± 5.7%，表明硝化作用受到抑制。松散结合型EPS（LB–EPS）和紧密结合型EPS（TB–EPS）在纳米颗粒胁迫下均显著增加，而HPLC–SEC和FEEM分析揭示高分子量、类蛋白和类富里酸SMP组分的积累。长期ZnO NPs暴露重构了微生物群落组成，并伴随着分类学和系统发育丰富度的降低，以及重要氮转化菌属如Nitrospira（硝化螺菌属）和Dechloromonas（脱氯单胞菌属）的大幅减少。总体而言，长期纳米颗粒暴露促进了微生物群落重构，增强了胞外胁迫响应，同时损害了重要的生物处理功能。

**论文解读**

**一、研究背景与问题提出**

氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）因其在电子、涂料、纺织、化妆品和包装材料等领域的广泛应用而被大量生产，随着消费量的增加，ZnO NPs日益出现在市政和工业废水中，使废水处理厂（WWTPs）成为其进入环境前的关键拦截节点。ZnO NPs虽然可通过吸附于污泥絮体和聚集作用被部分去除，但其在生物处理系统中的持久存在仍可能干扰微生物过程和污泥性质。膜生物反应器（MBR）因出水水质高、占地面积小和生物质截留效果好而被广泛用于深度废水处理，其性能高度依赖于复杂微生物群落的活性、稳定性和多样性。微生物群落不仅决定着处理性能，还调控胞外聚合物（EPS）和可溶性微生物产物（SMPs）的产生，这些物质影响污泥性质、絮体稳定性及胁迫条件下的胞外响应。ZnO NPs可通过颗粒–细胞相互作用、氧化应激、膜损伤以及颗粒溶解释放Zn²⁺等多种机制影响微生物，且ZnO的溶解对观察到的毒性有重要贡献。

尽管已有不少关于ZnO NPs对生物处理系统短期毒性的研究，但关于连续纳米颗粒暴露过程中微生物的长期适应和恢复能力的信息仍然十分有限。大多数既往研究主要关注反应器性能指标或数小时至数周的短期暴露，常在批次条件下进行，而关于连续运行MBR系统中超过100天的长期ZnO NPs暴露下微生物群落演变的信息尤为缺乏。此外，同时考察微生物群落重构与EPS及SMP特性变化的研究相对较少，长期纳米颗粒胁迫下微生物适应、群落重构、分类学和系统发育丰富度变化以及优势功能种群转变的机制仍缺乏清晰认识。

**二、研究内容与重要意义**

本研究以连续运行144天的浸没式缺氧–好氧MBR为研究对象，系统考察了递增浓度ZnO NPs（1 mg L^?1、10 mg L^?1和50 mg L^?1）长期暴露对微生物群落动态的影响，重点评价了纳米颗粒胁迫下微生物多样性、群落结构、优势功能菌属和胞外聚合物产生的变化，同时分析了LB–EPS、TB–EPS、SMPs特性、MW分布和荧光性质的变化。本研究的创新性在于将144天纳米颗粒暴露与分室特异性微生物群落变化、α-多样性响应、优势功能菌属及胞外胁迫指标（LB–EPS、TB–EPS、HPLC–SEC和FEEM图谱）联系起来，为理解纳米颗粒胁迫如何重塑工程化生物处理系统中的微生物生态和胞外保护响应提供了更清晰的认识。

**三、关键技术方法**

本研究构建了两个平行的实验室规模MBR系统，每个系统由3 L缺氧区和7 L好氧区组成，好氧池中浸没中空纤维超滤膜（聚偏氟乙烯材料，名义孔径0.04 μm）。接种污泥取自新加坡Ulu Pandan废水回收厂。反应器先运行3个月达到稳态，随后从第1天起在进水中加入1.0 mg/L ZnO NPs，第49天起提升至10 mg/L，第96天起提升至50 mg/L，连续运行144天。ZnO NPs购自Sigma-Aldrich，平均粒径为33 ± 8 nm。EPS和SMP采用改进的提取方法按LB–EPS、TB–EPS和SMP分级分离，蛋白质和多糖分别采用改良Lowry法和蒽酮-硫酸法定量。SMP的MW分布采用配备PL Aquagel-OH 8 μm MIXED-M色谱柱的高效液相色谱–尺寸排阻色谱（HPLC–SEC）测定。三维荧光激发–发射矩阵（FEEM）光谱采用LS55型荧光光谱仪测定。微生物群落分析基于16S rRNA基因V4高变区扩增和Illumina MiSeq双端测序（2 × 250 bp），采用QIIME流程进行序列质控、嵌合体去除和后续分析，操作分类单元（OTUs，Operational Taxonomic Units）在97%相似度水平上划分。统计分析包括配对t检验、单因素方差分析（ANOVA）、基于Bray–Curtis相异度的主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）。

**四、主要研究结果**

（1）反应器性能。ZnO NPs暴露导致反应器处理性能逐步恶化。1 mg/L ZnO NPs引入时化学需氧量（COD）去除无显著变化（p > 0.05），但10 mg/L条件下COD去除率从对照的93.1%降至90.1%。氨氮（NH₄⁺–N）去除受影响更为显著：1 mg/L时去除率为85.0% ± 2.5%，10 mg/L和50 mg/L时分别降至78.2% ± 5.8%和65.2% ± 5.7%（p < 0.05）。好氧上清液中溶解态Zn²⁺浓度随ZnO NPs暴露浓度递增从0.13 mg L^?1升至2.9和6.9 mg L^?1，Zn总去除率维持在约93%–94%，活性污泥生物吸附对Zn去除贡献约为62.3%–82.6%。污泥中Zn积累量随暴露浓度显著增加，最高暴露水平下生物质中Zn富集达14.6 wt%。MLSS在ZnO NPs处理反应器中显著降低，50 mg L^?1暴露期MBR-C平均为3.586 ± 0.249 g L^?1，MBR-T仅为2.054 ± 0.306 g L^?1（p = 5.31 × 10^?8）。磷去除也出现波动，暗示纳米颗粒胁迫影响了磷累积微生物和营养物转化途径。

（2）细菌EPS和SMP的产生。长期ZnO NPs暴露显著影响EPS和SMP的产生与组成。与对照相比，50 mg/L ZnO NPs暴露使SMP浓度从6.20 ± 0.47 mg g^?1 MLVSS增至23.06 ± 1.97 mg g^?1 MLVSS（p < 0.05），TB–EPS中蛋白质从76.1 ± 5.3增至105.3 ± 8.5 mg g^?1 MLVSS、多糖从42.7 ± 3.8增至54.3 ± 4.6 mg g^?1 MLVSS（p < 0.05）。TB–EPS的增加幅度大于LB–EPS，表明长期暴露促进了微生物聚集体和生物膜的结构性适应。HPLC–SEC分析显示ZnO NPs暴露反应器中高分子量SMP组分明显增加，缺氧区约583 kDa的峰吸收强度从约50 mAU升至90 mAU。FEEM光谱分析确定了三个主要荧光区域：A区（Ex/Em 225/360 nm）和B区（Ex/Em 275/350 nm）对应类色氨酸和类蛋白质物质，C区（Ex/Em 240/400 nm）对应类富里酸化合物。ZnO NPs暴露反应器在上述三个区域的荧光强度均显著增强，表明类蛋白和类富里酸SMP组分的积累增强。

（3）ZnO NPs对微生物群落的影响。每个样品获得18,845–79,979条高质量序列（平均45,010条），在97%相似度水平上每样品鉴定出243–665个OTUs。基于Bray–Curtis相异度的PCoA显示对照和处理反应器微生物群落明显分离，PERMANOVA证实处理间群落组成差异显著（pseudo-F = 3.46, R² = 0.257, p = 0.012）。ZnO NPs暴露与各MBR分室中较低的系统发育和分类学丰富度相关：Faith系统发育多样性指数在缺氧区从90.42 ± 1.89降至62.98 ± 1.81（p = 0.0045），Chao1丰富度和观测OTUs在ZnO NPs暴露群落中均呈下降趋势。在门水平上，Proteobacteria（变形菌门）从对照缺氧区的65%降至54%，Firmicutes（厚壁菌门）和Chloroflexi（绿弯菌门）也减少，而Planctomycetes（浮霉菌门）、Verrucomicrobia（疣微菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）和Actinobacteria（放线菌门）的相对丰度增加。在属水平上，缺氧区优势属Dechloromonas（脱氯单胞菌属）丰度从21%降至14%，而在好氧区从0.8%升至5.4%；好氧区的核心硝化菌Nitrospira（硝化螺菌属）丰度下降约80%（从11%降至3%）。Rhodocyclaceae（红环菌科）在缺氧区减少，而Saprospiraceae（腐螺旋菌科）和Cytophagaceae（噬纤维菌科）在生物膜中富集，Synechococcus（聚球藻属）也在处理反应器生物膜中富集。这些结果表明，ZnO NPs暴露抑制了关键营养物去除功能群，同时选择性富集了参与生物质降解和有机物转化的异养种群，群落结构从营养物去除专性菌为主转向更适应胁迫的异养型群落。

**五、讨论与结论**

综合EPS、HPLC–SEC和FEEM分析结果，长期ZnO NPs暴露诱导了显著的微生物胁迫响应。EPS基质的增加是微生物应对ZnO NPs暴露的防御策略——EPS可通过结合金属离子、吸附污染物和减少ZnO NPs与细胞的直接接触来降低纳米颗粒毒性。SMP中高分子量、类蛋白和类富里酸物质的积累则反映了纳米颗粒胁迫下细胞裂解增强和生物聚合物释放增加。微生物群落分析表明，ZnO NPs暴露导致的群落重构伴随着硝化菌和反硝化菌等功能群的减少和部分异养耐受类群的相对富集，群落倾向于从营养物去除专性菌为主向更适应胁迫的异养结构转变。Faith系统发育多样性的显著降低及Chao1丰富度和观测OTUs的下降趋势说明多样性丧失伴随着功能重要种群的抑制，并与氨氮去除性能的下降相一致。

研究结论表明：长期ZnO NPs暴露（144天）显著改变了浸没式缺氧–好氧MBR中微生物群落结构、胞外聚合物产生和SMP特性。递增浓度的ZnO NPs暴露导致各分室细菌群落发生实质性重构，并伴随营养物去除性能下降，特别是氨氮氧化。ZnO NPs暴露增加了LB–EPS和TB–EPS的产生，尤其紧密结合部分中蛋白质和多糖浓度显著增加；HPLC–SEC和FEEM分析进一步揭示了高分子量、类蛋白和类富里酸SMP组分的积累，这些胞外响应可能通过吸附、扩散限制和微生物聚集体及生物膜的稳定化来缓解纳米颗粒毒性。微生物群落分析显示ZnO NPs暴露显著改变了整体群落组成，并与各分室中较低的分类学和系统发育丰富度相关；这些群落水平的变化伴随着关键氮去除功能群的减少，而磷去除则涉及额外的非生物和EPS介导的滞留机制。与之相对，Saprospiraceae和Cytophagaceae等异养聚合物降解种群在生物膜群落中相对富集。总体而言，以ZnO NPs形式引入的逐步增加的Zn负荷导致MBR生物质中Zn大量积累，并伴随胞外胁迫响应增强、微生物群落重构、分类学和系统发育丰富度丧失及营养物去除性能恶化。由于实验期间未监测ZnO NPs的形态转化，完整纳米颗粒、溶解态Zn²⁺和转化或生物质结合态Zn物种的相对贡献无法区分，观察到的效应应主要解释为ZnO NPs暴露引起的Zn相关胁迫的响应，而非纳米颗粒特异性毒性的明确证据。未来研究应考察环境相关浓度的纳米颗粒效应，整合宏基因组或宏转录组学方法以更好地解析功能响应，并评价纳米颗粒诱导的微生物重构、膜污染发展与实际规模运行条件下处理性能之间的关系。