《Metabolism》：Keratin 8 Destabilization via O-GlcNAcylation Promotes Insulin Resistance in metabolic dysfunction associated steatotic liver disease
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摘要背景角蛋白8（K8）是肝细胞细胞骨架中间丝的组成成分之一，其功能受翻译后修饰的严格调控。O-GlcNAc化在肝病进展中起着关键作用。本研究旨在鉴定K8上的O-GlcNAc化位点，并阐明其在MASLD中的作用及分子机制。方法采用基因改造（K8缺陷型）和高脂饮食诱导的MASL
摘要
背景
角蛋白8（K8）是肝细胞细胞骨架中间丝的组成成分之一，其功能受翻译后修饰的严格调控。O-GlcNAc化在肝病进展中起着关键作用。本研究旨在鉴定K8上的O-GlcNAc化位点，并阐明其在MASLD中的作用及分子机制。
方法
采用基因改造（K8缺陷型）和高脂饮食诱导的MASLD小鼠，以及棕榈酸处理的肝细胞，通过免疫印迹、亲和力实验、共免疫沉淀和O-连接己糖胺蛋白质组学分析，评估K8的O-GlcNAc化动态及微纤维稳定性。同时评估代谢参数及mTOR/PI3K/AKT信号通路。利用介导K8敲低以及S9A突变型或野生型K8替代的病毒载体进行位点定向突变研究。
结果
MASLD模型显示K8的O-GlcNAc化水平升高，O-GlcNAc转移酶表达增加。蛋白质组学鉴定出Ser9为关键修饰位点。Ser9的O-GlcNAc化导致K8微纤维稳定性下降、可溶性K8增加，并抑制mTOR/PI3K/AKT磷酸化。S9A-K8突变体减少了O-GlcNAc化，恢复了细胞骨架稳定性和胰岛素信号传导，改善了葡萄糖耐受性和肝脂肪变性。
结论
Ser9依赖的K8 O-GlcNAc化通过破坏细胞骨架完整性并损害胰岛素信号传导，驱动MASLD相关的胰岛素抵抗。针对该修饰位点的干预可恢复代谢紊乱，为MASLD提供了潜在的新的治疗靶点。
引言
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种与代谢应激相关的慢性肝脏退行性疾病，其特征为脂肪变性，目前影响全球约38%的成年人[1]。MASLD的临床进展始于脂肪变性，可进展为脂肪性肝炎、显著纤维化，最终导致肝硬化。这一进展过程常伴随多种肝外代谢并发症，包括糖尿病、心血管事件、卒中、神经病变和慢性肾脏病[2]、[3]。尽管近期FDA批准的resmetirom和GLP-1激动剂显示了一定的疗效，但在超过70%的与代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）相关显著纤维化病例中，治疗反应仍然有限[4]。自2000年以来，MASH的进展使肝脏相关死亡率增加了4.2倍，成为肝移植的首要病因[5]、[6]。因此，迫切需要有效的MASLD治疗方法。
肝脏胰岛素抵抗（IR）是MASLD发病机制背后的关键代谢功能障碍，是全身代谢紊乱与进行性肝损伤之间的交汇点[7]。它表现为由于IRS1/2-PI3K-AKT级联信号受损导致肝脏葡萄糖生成抑制受损，这反而通过持续激活mTORC1-SREBP1c促进脂生成通路[8]。这种选择性IR诱导了一种代谢环境，其中高血糖与肝脂质积累并存，由持续的从头脂肪生成驱动，尽管糖异生控制受损[9]。胰岛素信号成分的分区分布，汇管区肝细胞通过IRS1优势维持脂肪生成能力，进一步凸显了这种二元性。关键的是，肝脏IR通过二酰甘油介导的PKCε激活和神经酰胺积累加剧脂质毒性，这不仅持续了局部胰岛素脱敏，还加剧了全身代谢功能障碍[10]。临床上，肝脏IR已被公认为MASLD的生物标志物和治疗靶点[11]。然而，肝脏IR异常中涉及的具体分子介质仍然不清楚。
细胞骨架调节在胰岛素信号转导中起着至关重要的作用[12]、[13]、[14]。角蛋白8（K8）与角蛋白18形成异二聚体，是肝细胞中间丝的主要成分[15]。这些微纤维为细胞结构提供必要的结构完整性，同时通过翻译后修饰（PTMs）维持显著的塑性，使其能够快速适应微环境应激[16]。我们先前的研究表明，K8突变可能增加MASLD患者对IR的易感性[17]。K8基因敲除小鼠因肝脏PI3K/mTOR激活受损而表现出基础葡萄糖摄取和乳酸产生增加[18]。在超过200种角蛋白PTMs中，O-GlcNAc化表现出营养响应动态，并与保守的Ser/Thr残基上的磷酸化竞争。这种由O-GlcNAc转移酶（OGT）介导的UDP-GlcNAc依赖修饰可能影响K8微纤维的组装和功能[19]、[20]。虽然已在K18头结构域中绘制了三个O-GlcNAc化位点，即Ser29、Ser30和Ser48[21]，但K8上的O-GlcNAc化位点仍未被鉴定。基于这些线索，本研究调查MASLD相关的IR是否与K8 O-GlcNAc化负担相关。
为此，我们利用野生型和K8敲低（K8-KD）小鼠及肝细胞模型，绘制了MASLD中K8相关的O-GlcNAc图谱，并探讨了其与MASLD中细胞骨架微纤维和肝脏IR的联系机制。
章节摘要
人体样本
来自患有脂肪肝疾病和正常对照组的患者的肝脏组织，取自中山大学第一附属医院接受肝活检或肝移植的患者。两名对临床信息不知情的病理学家独立进行了组织学分析[22]、[23]。所有参与者均签署了知情同意书，实验程序获得了医院伦理委员会的批准（批准编号：
脂肪变性诱导的MASLD中伴胰岛素抵抗的肝脏K8 O-GlcNAc化
我们首先调查了小鼠模型中肝脏蛋白O-GlcNAc化的水平。尽管K8表达无可检测变化，免疫荧光和免疫印迹分析显示，与对照组相比，高脂饮食小鼠肝脏中的整体O-GlcNAc化显著增加（P < 0.05，图1A-B）。MASLD患者肝脏组织的免疫组化分析显示了一致的模式：K8表达保持不变，而O-GlcNAc化升高（图1C）。此外，sWGA拉下实验
讨论
肝脏作为胰岛素作用的主要器官，因信号通路失调而在IR的发病机制中起着至关重要的作用。本研究表明，K8的O-GlcNAc化破坏了结构稳定性，随后抑制了mTOR/PI3K/AKT信号通路的激活，从而扰乱了肝脏的葡萄糖和脂质代谢。此外，K8的Ser9已被鉴定为O-GlcNAc化位点，Ser9突变体通过
作者贡献声明
Long Teng：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿撰写，可视化，验证，软件，资源，方法论，正式分析，数据整理，概念化。Ling Luo：写作 – 初稿撰写，可视化，验证，软件，资源，方法论，调查，正式分析，数据整理，概念化。Jiaming Lai：可视化，验证，软件，方法论，数据整理。Congxiang Shao：写作 – 初稿撰写，可视化，验证，资源，
伦理声明
所有动物实验均按照美国国家卫生研究院《实验室动物护理与使用指南》进行，并获得了中山大学第一附属医院机构动物护理和使用委员会的批准（方案批准编号：[2023]345）。
涉及人体组织样本的研究按照《赫尔辛基宣言》进行。研究方案经
资金
本研究部分由国家自然科学基金（82400663、82370587和82100648）及广东省自然科学基金（2022A1515012369）资助。资助方未参与研究设计、数据收集、分析、解释、稿件撰写，也未参与决定投稿发表。
利益冲突声明
作者声明不存在已知的影响本文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
Long Teng|Ling Luo|Jiaming Lai|Congxiang Shao|Bihui Zhong|Junzhao Ye
中山大学第一附属医院消化内科，中国广东省广州市越秀区中山二路58号
