《Microchemical Journal》：Split malachite green aptamer transcription-based AND logic fluorescent platform: A novel approach for dual-miRNA detection in diabetes mellitus complicated with Alzheimer's disease
编辑推荐：
•开发了一种用于糖尿病合并阿尔茨海默病双 miRNA 检测的与非逻辑荧光芯片。•自引物循环扩增和双滚环扩增实现了超灵敏 miRNA 分析。•分裂孔雀石绿适配体转录允许无标记、催化放大的荧光信号生成。•该芯片对两种 miRNA 均达到 0.15 fM 的检出限，并对错配序列具有
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开发了一种用于糖尿病合并阿尔茨海默病双 miRNA 检测的与非逻辑荧光芯片。
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自引物循环扩增和双滚环扩增实现了超灵敏 miRNA 分析。
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分裂孔雀石绿适配体转录允许无标记、催化放大的荧光信号生成。
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该芯片对两种 miRNA 均达到 0.15 fM 的检出限，并对错配序列具有优异的特异性。
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临床血清分析显示该芯片对 DMAD 诊断的敏感性为 87.5%，优于单 miRNA RT-qPCR。
引言
糖尿病合并阿尔茨海默病 (DMAD) 是一种常见且复杂的合并症，其中阿尔茨海默病 (AD) 是一种进行性神经退行性疾病，是痴呆最常见的原因，但其早期诊断仍是重大的临床挑战 [1], [2]。已知早期干预可改善治疗效果；因此，迫切需要 DMAD 初期的可靠生物标志物。新出现的证据已确定微小 RNA (miRNA) 为有前景的无创诊断生物标志物，因为它们在基因表达中的调控作用及其在生物流体中的稳定性 [3], [4]。特别是，miRNA-34a 和 miRNA-132 已被证明在 DMAD 进展过程中失调，据报道，与单 miRNA 分析相比，它们的联合检测可显著增强早期 DMAD 诊断的准确性 [5]。从机制上讲，这两种 miRNA 在 DMAD 中均上调，并通过调节涉及胰岛素抵抗、神经炎症和 tau 蛋白病理的关键信号通路参与发病过程，从而促成疾病的发展和进展。因此，开发一种能够同时检测这两种 miRNA 的稳健双靶标分析技术，对于提高早期诊断精度和理解 DMAD 发病机制具有重要的价值。
目前用于 miRNA 检测的方法包括逆转录定量聚合酶链反应 (RT-qPCR) [6]、北方印迹法 [7], [8] 和下一代测序 (NGS) [9]。其中，RT-qPCR 因其高敏感性和特异性而被广泛认为是 miRNA 分析的金标准。然而，该技术受到几个内在局限性的阻碍，包括需要热循环、依赖专用且昂贵的仪器，以及需要可能引入 miRNA 定量偏差的逆转录步骤。北方印迹法虽然提供了 miRNA 的直接可视化和大小确认，但通量低、灵敏度差且样本消耗相对较大。尽管下一代测序 (NGS) 能够无偏倚地发现新型 miRNA，但涉及繁琐的文库构建、高昂的试剂成本和复杂的生物信息学分析，限制了其在临床环境中的常规使用。为应对这些挑战，近年来开发了各种等温核酸扩增技术 [10], [11], [12], [13]，例如滚环转录 (RCT) [14], [15], [16]、指数扩增反应 (EXPAR) [17], [18] 和环介导等温扩增 (LAMP) [19], [20], [21], [22]，并在构建灵敏的 miRNA 检测平台中发挥了关键作用。特别是，RCT 具有独特的优势，包括反应条件简单、进程性高以及能够产生具有重复序列的长链单链 DNA 或 RNA 产物。因此，基于 RCT 的策略已被广泛用于 miRNA 检测。尽管取得了这些显著进展，但依赖等温扩增的方法仍面临几个需要进一步改进的关键问题。首先，大多数这些方法旨在进行单重 miRNA 分析，限制了它们捕获多种 miRNA 生物标志物组合诊断价值的能力。其次，由引物错配或非预期模板相互作用引起的非特异性扩增可能导致假阳性结果，损害检测可靠性。最后，降低背景信号仍然是一个挑战，因为升高的基线噪声会掩盖真正的阳性信号并破坏检测稳定性，特别是在复杂的生物基质中。
为了在单次检测中同时检测多种 miRNA 生物标志物，基于逻辑门的生物传感策略作为一种强大且优雅的方案应运而生 [23], [24], [25]。受数字电路启发，逻辑门传感器利用生物分子输入（如 miRNA）通过工程化的分子识别和扩增网络触发预定义的输出信号 [26]。在各种逻辑运算中，“与非”逻辑门对于双靶标分析特别具有吸引力，因为它只有在两种指定的 miRNA 输入均存在时才产生阳性输出，从而提供高特异性并减少来自单个脱靶信号的假阳性读数可能性 [27]。这一特征使得与非逻辑门非常适合构建双 miRNA 检测平台，特别是在像阿尔茨海默病这类需要多种生物标志物进行准确诊断的复杂疾病背景下。同时，孔雀石绿 (MG) 是一种荧光染料，在其游离形式下荧光可忽略不计，但在与其同源 RNA 适配体结合时发出强烈的荧光 [28], [29], [30]。这一独特性质赋予了 MG 作为信号报告物的几个优势，包括高信噪比、快速响应和优异的光稳定性。值得注意的是，MG 适配体可以催化增强 MG 的荧光生成，无需外源酶促扩增或化学偶联步骤即可实现灵敏的实时信号读数，使其成为基于逻辑门的生物传感系统中一种诱人的报告模块。
为应对上述局限性并进一步提高阿尔茨海默病的诊断性能，我们开发了一种基于“与非”逻辑门的荧光平台，该平台整合了自引物循环扩增与 RCT 介导的分裂孔雀石绿 (MG) 适配体转录，实现了对 miRNA-34a 和 miRNA-132 的超灵敏且稳健的同时检测。在此设计中，两种靶标 miRNA 的存在触发了自引物循环扩增过程，该过程实现了高效的目标回收并将 Y 形探针 (YP) 释放到芯片表面。表面锚定的 YP 随后引发双 RCT，导致转录出两个长链单链 DNA 产物，每个产物均包含分裂 MG 适配体序列的串联重复。这两个 RCT 产物可以组装成完整的 MG 适配体，能够与 MG 结合，从而产生强烈的荧光信号。得益于这种合理的设计，所提出的方法表现出极高的检测灵敏度，对两种 miRNA 的检出限低至 0.15 fM，并具有优异的抗干扰能力。鉴于这些优势，这种基于分裂适配体转录的荧光平台有望成为阿尔茨海默病及其他复杂疾病早期诊断中多重 miRNA 分析的可靠且通用的平台。
章节摘要
试剂与材料
所有寡核苷酸（包括 s1、s2、s3、SP-1、SP-2、padlock-1、padlock-2、靶标 miRNA、错配 miRNA 和不相关 miRNA）均由上海生工生物工程有限公司（中国上海）合成并经 HPLC 纯化。孔雀石绿 (MG) 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海）。DNA 聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs) 购自赛默飞世尔科技公司（中国北京）。限制性内切核酸酶 (Nb.BbvCI) 和 T7 RNA 聚合酶
所构建与非门荧光平台的工作机制
所构建的基于与非门的荧光芯片的工作机制如图 1 所示。固定在芯片表面的检测探针 (DP) 作为核心组件，既起靶标识别作用，又起信号报告作用。具体而言，DP@chip 是基于 Y 形探针 (YP)@chip 组装的，其中 YP 由三股链组成：s1、s2 和 s3。两个发夹结构的自引物探针 (SPs) 杂交到 YP 的两个起始结合区，即起始结合区 -1
结论
总之，我们成功开发了一种基于“与非”逻辑门的荧光芯片，该芯片整合了自引物循环扩增与 RCT 介导的分裂孔雀石绿适配体转录，用于同时检测两种与 DMAD 相关的微小 RNA：miRNA-34a 和 miRNA-132。本工作展示了几个显著的创新能力 (表 S2)。首先，靶标回收自引物扩增与锚定在芯片表面的双 RCT 的合理组合实现了超高
CRediT 作者贡献声明
Ji Chen：写作 – 原稿，验证，方法论，调查，构思。Lumiao Liao：写作 – 原稿，方法论，构思。Hongming Lu：写作 – 原稿，可视化，验证，构思。Yuting Hu：形式分析。Huilan Yang：软件。Danping Zhu：资源。Jinlin Wu：写作 – 审查与编辑，构思。Xi Mei：写作 – 审查与编辑，监督，构思。
伦理批准与参与同意
本研究已获成都医学院第一附属医院机构审查委员会批准（批准号：2026CYFYIRB-BA-129）。所有涉及人体血清样本的操作均按照机构和国家级研究委员会的道德标准以及 1964 年《赫尔辛基宣言》及其后续修正案进行。在样本收集前，已获所有受试者的书面知情同意。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文中报告的工作。
资助
资金来自成都医学院四川省应用心理学研究中心（编号：CSXL-23307）及资助来源：成都市卫生健康委员会医学研究项目（编号：2023167）。
Ji Chen|Lumiao Liao|Hongming Lu|Yuting Hu|Huilan Yang|Danping Zhu|Jinlin Wu|Xi Mei
