脑室内注射神经肽Y抑制小鼠黄体生成素脉冲

《Journal of Neuroendocrinology》：Intracerebroventricular injection of neuropeptide Y suppresses luteinizing hormone pulses in mice

　　

压力会损害生殖功能，其部分机制是通过抑制Kisspeptin/Neurokinin B/Dynorphin (KNDy)细胞和抑制促性腺激素分泌来实现的。然而，这种抑制作用的机制尚不清楚。神经肽Y (NPY)是一种多效性分子，由全脑神经元产生，介导包括能量稳态和应激反应在内的多种生理过程。中枢给予NPY对黄体生成素（LH）分泌的影响因物种、性腺状态和输注部位而异。因此，本研究旨在确定中枢给予NPY对小鼠LH脉冲的体内作用。研究人员收集了接受中枢注射NPY或生理盐水（对照）的雄性和雌性小鼠的频繁血样，并检测了LH浓度。此外，还进行了补充研究，即对NPY或生理盐水处理的动物给予kisspeptin刺激，以评估其对GnRH细胞的直接影响，或收集组织以评估与KNDy细胞相关的转录本。脑室内注射（ICV）NPY显著抑制了卵巢切除（OVX）雌性和去势（GDX）雄性小鼠的LH脉冲。然而，同样的处理在性腺完整的雄性小鼠中产生了不同的反应，并且对雌激素替代的OVX雌性小鼠的分析显示，短暂的异氟烷暴露后出现了意料之外的LH抑制。在对KNDy神经元的评估中，研究人员发现，在ICV注射NPY后1小时，弓状核微穿刺样本中编码强啡肽的mRNA丰度有统计学意义的增加。为进一步支持NPY损害KNDy细胞的假说，研究人员发现，预先用NPY或生理盐水处理的动物对外源性kisspeptin的反应相同，这表明促性腺激素释放激素神经元和促性腺激素细胞仍然对刺激保持完全响应。研究人员得出结论，NPY足以抑制OVX雌性和GDX雄性小鼠的LH分泌，并且这种抑制很可能由弓状核中的KNDy细胞介导。

论文主体内容解读

研究背景与目的

哺乳动物在面临逆境时会优先考虑生存。由于繁殖的能量消耗巨大，生物进化出了在压力状态下（包括营养不良/饥饿）抑制生育能力的机制。这些机制至少部分体现在下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）的抑制上，通常表现为促性腺激素分泌减少。例如，束缚应激、脂多糖（LPS）诱导的免疫/炎症应激以及胰岛素诱导的低血糖（IIH）等多种应激模型均能在不同物种中抑制黄体生成素（LH）的脉冲式分泌。

位于弓状核（ARC）内共表达Kisspeptin、神经激肽B和强啡肽的神经元，被称为KNDy细胞，它们构成了促性腺激素释放激素（GnRH）脉冲发生器。现有证据表明，KNDy神经元在应激状态下会受到抑制。然而，介导这种抑制的确切机制仍是一个待解决的关键问题。

神经肽Y（NPY）是一种在大脑中广泛表达的多效性神经肽，以其在摄食调节和应激反应中的作用而闻名。已有研究表明，NPY能够调节促性腺激素的分泌，但其效果因物种、性腺状态和注射位点等因素而异。因此，本研究的主要目的是：1）确定中枢注射NPY是否足以抑制小鼠的LH脉冲；2）探究这种抑制作用是否由KNDy神经元介导。

关键技术方法

本研究使用了成年C57BL/6J小鼠作为实验对象，所有动物均来自美国科罗拉多州立大学（Colorado State University）的动物房。主要技术方法包括：

1. 1.
   动物模型建立：通过手术对雌性小鼠进行卵巢切除术（OVX），部分小鼠植入含雌二醇（E2）的硅胶管以模拟间情期雌激素水平；对雄性小鼠进行去势术（GDX）。
2. 2.
   中枢给药：采用徒手脑室内注射（ICV）技术，向侧脑室注射NPY或生理盐水（对照）。
3. 3.
   激素检测：通过尾尖采血法频繁采集血液样本，并使用超灵敏酶联免疫吸附试验（ELISA）测定LH浓度。
4. 4.
   脉冲分析：使用改良的PULSAR算法确定LH脉冲的参数（平均LH浓度、脉冲幅度和脉冲次数）。
5. 5.
   基因表达分析：通过显微切割获取弓状核（ARC）组织，提取RNA后进行逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），检测KNDy相关基因（Kiss1, Tac2, Pdyn）的mRNA丰度。
6. 6.
   Kisspeptin挑战实验：在注射NPY或生理盐水后，给予外源性kisspeptin，以评估GnRH神经元和促性腺激素细胞的功能完整性。

研究结果

3.1 实验1：中枢NPY给药抑制雌性小鼠的LH脉冲

在OVX+Oil（油剂）小鼠中，ICV注射NPY后，平均LH浓度、LH脉冲幅度和脉冲次数均显著降低，而注射生理盐水的对照组无变化。在OVX+E2（雌激素）小鼠中，NPY同样显著降低了平均LH浓度和脉冲幅度。然而，在该组中，无论是NPY还是生理盐水处理后，LH脉冲次数均随时间下降，这提示实验操作本身可能产生了影响。

3.2 实验2：短暂异氟烷暴露抑制E2替代OVX小鼠的LH脉冲

为验证上述猜想，研究人员发现，仅对OVX+E2小鼠进行模拟ICV注射所需的短暂异氟烷麻醉，就足以显著降低其平均LH浓度和脉冲次数。这表明E2替代的OVX小鼠对异氟烷麻醉和操作应激更为敏感。

3.3 实验3：中枢NPY给药抑制雄性小鼠的LH脉冲

在GDX雄性小鼠中，ICV注射NPY显著抑制了平均LH浓度、脉冲幅度和脉冲次数，而生理盐水无此效应。在性腺完整的雄性小鼠中，NPY显著减少了脉冲次数，但对平均LH和脉冲幅度的影响与生理盐水组相比无显著交互作用，这可能与完整雄性小鼠基础LH水平低、波动大有关。

3.4 实验4：ICV注射NPY 3小时后不改变小鼠KNDy产物的mRNA丰度

在注射NPY或生理盐水3小时后，无论何种性腺状态的动物，其ARC中Kiss1、Tac2和Pdyn的mRNA丰度均无显著差异。

3.5 实验5：ICV注射NPY 1小时后改变OVX小鼠KNDy产物的mRNA丰度

鉴于部分动物在3小时后LH脉冲可能已经恢复，研究人员检查了更早的时间点（1小时）。结果显示，在OVX+Oil小鼠中，NPY注射1小时后，Pdyn（编码强啡肽）的mRNA丰度显著高于生理盐水对照组，而Kiss1和Tac2的丰度无显著差异。

3.6 实验6：ICV注射NPY不抑制OVX小鼠对kisspeptin的LH反应

为了确定NPY的作用位点是否在KNDy细胞下游，研究人员发现，无论预先注射的是NPY还是生理盐水，所有小鼠在接受外源性kisspeptin后，LH水平都出现了相似的显著升高。这表明NPY的抑制作用发生在KNDy细胞或其上游，并未损害GnRH神经元和垂体促性腺激素细胞的功能。

讨论与结论

讨论总结：本研究证实，中枢注射NPY能够有效抑制去性腺（OVX和GDX）雄性和雌性小鼠的LH脉冲分泌。这一结果与在绵羊、大鼠等物种中观察到的抑制效应一致，但与在猴子和卵巢完整兔子中观察到的刺激效应相反，这提示NPY的作用存在显著的物种和位点特异性。研究还发现，E2替代的OVX小鼠对异氟烷麻醉和操作应激异常敏感，这揭示了此类研究中一个重要的方法学限制。

NPY的作用位点可能涉及多个脑区，包括含有GnRH神经元胞体的视前区（POA）、富含KNDy细胞的ARC以及参与应激反应的室旁核（PVN）。但kisspeptin挑战实验的结果强烈提示，NPY并非直接作用于GnRH神经元或垂体，而是作用于其上游的KNDy细胞。进一步的分子证据显示，NPY注射后1小时，ARC中编码抑制性肽——强啡肽的Pdyn mRNA水平显著升高。由于强啡肽在KNDy网络中负责终止脉冲和建立抑制性张力，其上调很可能是NPY抑制LH脉冲的直接原因。

研究结论：综上所述，这些数据表明，ICV注射NPY足以抑制无性类固醇条件下小鼠的LH脉冲分泌。此外，这种LH分泌障碍很可能由ARC中的KNDy细胞介导，其证据包括：编码抑制性肽强啡肽的mRNA丰度发生变化，以及在NPY诱导的LH抑制后，对外源性kisspeptin的LH反应未受影响。这些数据共同为NPY与促性腺激素脉冲式分泌调控之间的功能联系提供了更多证据。