基于H218O技术与膜入口质谱的小体积均匀辐照培养室改进初级生产力与总呼吸测量

《Journal of Phycology》：Improved primary production and gross respiration measurements using the H218O technique with membrane inlet mass spectrometry and introduction of a small volume–uniform irradiance incubation chamber

　　

本文描述了一种用于浮游植物总初级生产力（gross primary production, GPP）、净初级生产力（net primary production, NPP）和总呼吸（gross respiration, GR）测量的H₂¹⁸O技术改进方法，与传统同位素比质谱仪（isotope ratio mass spectrometer, IRMS）方法相比，该方法降低了成本、劳动和时间消耗。研究人员对膜入口质谱（membrane inlet mass spectrometry, MIMS）进行了优化，使其能够测量小体积（3 mL）样品，并实现低同位素富集（1% ¹⁸O）和高分析精度（约1‰）。研究人员使用一种光合培养装置（photosynthetron）测定了GPP、NPP和GR的多达10点光响应曲线，每次实验仅需总计50 mL样品水，同位素成本低于15美元。此外，本研究还描述了一种新的培养装置——Coronatron，该装置可在均匀辐照条件下对多达12个样品进行营养盐操控。研究展示了来自高度差异的天然水样的示例光曲线，显示相对于NPP升高的GPP以及显著的光刺激GR。为突出改进方法的优势，还展示了营养盐操控曲线，显示了在恒定光照下GPP、NPP和GR随环境硝酸盐浓度及不同温度的变化。

浮游植物通过光合作用贡献了水体中大量的氧气（O₂）生产。准确测定不同水生环境中氧气的释放过程（即总初级生产力GPP和净初级生产力NPP）与消耗过程（呼吸R）具有重要的生态学意义。自Gaarder和Gran（1927）提出经典的“亮瓶-暗瓶”法以来，该方法通过成对的光照和黑暗培养直接测定NPP和群落呼吸（CR），并据此推算GPP。然而，暗瓶测量中的CR包含水体中所有生物（细菌、自养生物、异养生物、浮游动物等）的耗氧，因此可能对GPP估算产生较大干扰；该方法还隐含假设CR不受光照影响。20世纪50年代的研究发现，光合作用中存在光依赖的O₂消耗过程（如Mehler反应、光呼吸等），这些过程无法被暗瓶测定捕获。虽然利用¹⁸O同位素稀释技术可以区分O₂产生与消耗，但传统同位素比质谱（IRMS）设备昂贵、操作复杂，限制了其在自然浮游植物研究中的广泛应用。膜入口质谱（MIMS）反应快、成本较低，但早期精度不足。Ferrón等（2016）证明了MIMS在寡营养海洋样品中测定GPP和NPP的可行性，但仍有必要进一步降低样品体积和同位素成本，以提高实验灵活性和可扩展性。

为此，研究人员优化了基于H₂¹⁸O技术的MIMS分析方法，使仪器可在3 mL小体积样品和1%（体积比）低同位素富集条件下，以约1‰的高精度测定氧同位素比值。研究中还使用了两种培养装置：一种是可同时设置多个光梯度（最多10个光强）的“光合培养装置”（photosynthetron）；另一种是本研究新设计的“Coronatron”——一种球形均匀辐照培养装置，可容纳12个样品，并在恒定光照下进行营养盐或温度操控。研究人员利用来自佛罗里达州夏洛特港、马里兰州乔普坦克河、佛罗里达州萨拉索塔湖和萨拉索塔新航道等不同营养水平和盐度环境的水样，以及一株非无菌凯伦藻（*Karenia brevis*）培养物（分离自新航道，由莫特海洋实验室提供），开展了光响应曲线、营养盐添加和温度梯度实验。研究发现，该方法能够同时量化GPP、NPP和GR，且每次实验同位素成本低于15美元，样品总需水量仅50 mL，显著降低了成本和工作量。该方法还为研究自然浮游植物中光依赖呼吸提供了新的手段，具有重要的方法学意义。

在关键技术方面，研究人员采用MIMS测量水中溶解的³²O₂/⁴⁰Ar和³⁴O₂/⁴⁰Ar比值，以惰性气体氩（Ar）作为参考气体，避免了高活性样品中O₂浓度变化对参考信号的影响。样品经100 μm尼龙网筛滤后，加入终浓度为1%的高丰度（>98%）H₂¹⁸O，分装至3 mL螺口玻璃瓶（Labco Exetainer），采用Viton隔垫密封并排尽气泡，用饱和HgCl₂固定终止培养。在Photosynthetron中，光强通过中性密度滤光膜调节，光响应实验涵盖从限制光到饱和光（约1000 μmol photons·m^?2·s^?1）的范围；在Coronatron中，12个样品置于球形积分腔内，接收均匀光照，并通过外置恒温培养箱控制温度。GPP由³⁴O₂/⁴⁰Ar比值的时间变化计算，NPP由³²O₂/⁴⁰Ar净变化计算，GR为GPP与NPP之差；所有速率均按叶绿素a浓度归一化。数据可视化采用LOESS平滑，并利用Jassby和Platt（1976）模型拟合光合-辐照度关系。研究样本队列来源包括：美国佛罗里达州夏洛特港（Chl a 2.22 μg·L^?1，25°C，盐度31）、马里兰州乔普坦克河（Chl a 5.04和9.91 μg·L^?1，21–24°C，盐度15）、佛罗里达州萨拉索塔湖的微囊藻（*Microcystis* sp.）水华（Chl a 262 μg·L^?1，25°C）、凯伦藻培养物（Chl a 156 μg·L^?1，25°C，盐度30）以及新航道站点的天然水样（Chl a 2.20 μg·L^?1，20°C）。

研究结果分为四部分：

**初级生产和总呼吸作为光的函数（PE曲线）** 利用Photosynthetron对高对比度天然水样和培养物进行光梯度培养，发现GPP和NPP表现为经典的双曲线光响应，饱和辐照度（E_k）范围为40–423 μmol photons·m^?2·s^?1；在约1000 μmol photons·m^?2·s^?1的最高光强下，除*Microcystis* sp.外均出现光抑制现象。GR的光响应因群落组成而异：在凯伦藻培养物中，GR随光强增加，最高占GPP的47%；而在微囊藻水华期间，GR在所有光强下均较低且无明显光依赖性，这更符合蓝藻的特征。

**初级生产和总呼吸作为营养盐和温度的函数** 利用Coronatron在恒定光强（约120 μmol photons·m^?2·s^?1）下，对新航道水样进行不同硝酸盐（NO₃^?）添加（0、1、5、10 μM）和不同温度（20、24、28°C）的培养。结果显示，GPP随硝酸盐添加略有升高，但在28°C时最低；NPP在富营养条件下较高，但在28°C时变为负值；GR随硝酸盐添加先升后降，且28°C时最大，超过GPP和NPP。这表明营养盐富集可刺激初级生产，但升温可能通过增加GR而削弱这一效应。

**样品储存实验** 将乔普坦克河水样经Coronatron培养6 h后固定保存，分别在1、7、30天测定氧同位素比值。³²O₂/⁴⁰Ar在1–7天内保持稳定（16.86和16.84），第30天略降至16.01；而³⁴O₂/⁴⁰Ar在第7天即从0.086降至0.076，第30天进一步降至0.067，表明储存30天会导致同位素信号损失，³⁴O₂损失更明显，这与Viton隔垫的气体渗透性一致，因此固定后的样品应尽快分析。

**采样精度** 对所有T0和Tf样品的³⁴O₂/³²O₂信号计算变异系数（CV），大多数样品（86.6%）的CV小于0.10%，仅少数Tf样品CV为0.1%–0.9%，表明方法的重复性和精度均较高。

在讨论部分，研究人员指出，传统亮瓶-暗瓶法假设呼吸速率与光照无关，但光依赖呼吸过程（如Mehler反应、环式电子流、光呼吸）在自然浮游植物中普遍存在且变异显著。H₂¹⁸O方法直接反映光系统II（PSII）活性，因此其测得的GPP可能高于非同位素方法所估算的GPP，因为光合还原力可流向O₂还原而非CO₂固定。本研究建立的小体积、低富集、低成本的MIMS-H₂¹⁸O方法，结合Photosynthetron和Coronatron两种培养装置，为系统研究浮游植物的光依赖呼吸及其对环境因子（光、温度、营养盐）的响应提供了有力工具。同时，低生物量样品的测定仍需进一步优化取样和操作流程。

研究结论可翻译为：本研究推进了H₂¹⁸O技术结合MIMS的应用，证明了其在天然浮游植物群落中使用小体积培养（3 mL）同时量化GPP、NPP和GR的有效性。借助包括Coronatron和Photosynthetron在内的先进培养装置，该方法增强了研究浮游植物对光、温度和营养盐等多种环境因子生理响应的能力。与传统方法相比，本文所述技术更简单、更经济、更快速，从而可实现更广泛的应用。尽管在低生物量样品的可靠测量方面仍需方法改进，但在不同水生环境中展示的可重复性和效率凸显了该方法的稳健性。总体而言，这些方法改进有助于更准确、更全面地理解不同环境中浮游植物生产力及暗呼吸和光依赖呼吸的变化，为水生光合作用研究中的比较研究和模型开发提供了新的机遇。