《Molecular Ecology》：Genomic Tracking of Market-Derived Bull Shark Fins Back to Source Population of Origin
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摘要专业翻译
鲨鱼鱼翅的国际贸易仍难以监测，因为产品很少标注物种信息，且通常经过深度加工，导致DNA严重降解。对于列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录II的多种鲨鱼物种，这限制了对供应全球贸易枢纽的源种群进行外部核验。本研究评估了核基因组方法
摘要专业翻译
鲨鱼鱼翅的国际贸易仍难以监测，因为产品很少标注物种信息，且通常经过深度加工，导致DNA严重降解。对于列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录II的多种鲨鱼物种，这限制了对供应全球贸易枢纽的源种群进行外部核验。本研究评估了核基因组方法是否可应用于市场来源的牛鲨（Carcharhinus leucas）鱼翅以确定其种群来源。研究人员分析了从中国香港特别行政区（全球最大的干鱼翅贸易枢纽之一）零售商户采集的干鱼翅修剪碎料，使用了一套针对该物种种群基因组研究开发的靶向DArTcap单核苷酸多态性（SNP）panel。尽管DNA严重降解，大多数样本仍成功获得基因组文库，产生了足以进行稳健来源地和性别鉴定的SNP数据。通过贝叶斯混合种群分析（Bayesian mixed-stock analysis），大多数鱼翅样本被归属至印度-西太平洋（Indo-West Pacific, IWP）（71.4%），其次为西大西洋（western Atlantic, W-ATL）（22.6%）和东太平洋（eastern Pacific, E-PAC）（3.0%）。遗传性别鉴定显示雄性数量为雌性的两倍，但结果表明由于降解样本中可用的X连锁标记数量有限，存在偏向雄性鉴定的保守性偏差。本研究结果证明，全基因组靶向方法可有效应用于深度加工的鱼翅产品，以推断种群来源和性别组成。本研究为将基因组学整合入鲨鱼贸易监测提供了概念验证，凸显了其在提升可追溯性、支持CITES实施以及为保护和渔业管理提供信息方面的潜力，尤其适用于种群结构解析良好的物种。
论文解读文章
一、研究背景与问题
鲨鱼制品（如鱼肉和干鱼翅）频繁跨越国际边界进行贸易，众多捕捞国的供应链最终汇聚于少数国际交易枢纽和消费国。尽管在泛化的“鲨鱼”层面贸易流向已较为清晰，但由于鲨鱼产品极少标注物种信息，物种特异性的供应链往往不透明。过去十年间，已有超过100种鲨鱼和鳐鱼物种被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录II，该附录允许在符合捕捞国法律、可持续且有文件记录的前提下进行国际贸易。若合规性高，通过CITES的贸易文件记录本可更好地解析物种特异性供应链。
遗传学方法（单或双位点线粒体DNA测序）近期已被用于推断国际贸易流向，通过揭示源种群对交易枢纽或市场样本的贡献，已应用于少数鲨鱼物种。将市场鱼翅样本的遗传混合种群分析与同一市场的CITES进口记录进行比较，常发现只能用未记录因而非法的贸易来解释的差异。在少数情况下，线粒体单核苷酸多态性（SNP）可用于将单个鱼翅归属至来源种群，但在大多数单位点研究中，诊断性SNP数量不足，需要对市场样本进行混合种群分析。更全面的产品追踪工作可通过核基因组方法实现，该方法可同时检测更多位点，并能可靠地将样本中的每个个体产品归属来源地。核SNP panel已越来越多地应用于野生动物和食品法医学，能够从加工和交易的动物产品中进行可靠的遗传推断，包括使用性别连锁标记进行性别鉴定。
牛鲨（Carcharhinus leucas）是一种大型、环热带分布的鲨鱼物种，被国际自然保护联盟（IUCN）列为全球“易危”（Vulnerable）物种，并于2022年被列入CITES附录II。该物种在世界许多未对鲨鱼渔业进行可持续管理的地区被捕捞，作为顶级捕食者，牛鲨的枯竭可能对生态系统结构和功能产生不成比例的影响。国际干鱼翅贸易是牛鲨捕捞的主要驱动力，其鱼翅在香港这一全球最大的鱼翅贸易枢纽之一以特定的高价值商品名（“沙青”）销售。1999年10月至2001年3月期间，牛鲨占香港鱼翅贸易的至少1.8%–2.6%，据此估算全球年死亡率达数十万至约150万尾。2014–2021年更近期的鱼翅市场调查确认该物种仍是市场中最常见的物种之一。沙青鱼翅的贴标发生在鱼翅进口之后，关于牛鲨鱼翅的全球供应链信息有限。牛鲨是沿海和归家性（philopatric）物种，其独特的线粒体控制区序列特征可区分占据被广阔洋面和冷水隔开的大陆架的种群。近期基因组研究利用核SNP进一步细化了该物种的种群结构认知，检测到更多局域性结构。具体而言，Devloo-Delva等人（2023）确定250–500个信息性SNP足以在洋盆和岛屿种群水平（即东太平洋E-PAC、西大西洋W-ATL、东大西洋E-ATL、印度-西太平洋IWP、日本JAP和斐济FIJ）实现接近100%的来源地鉴定准确率。
干鱼翅通常在进口后很快被加工（去皮和漂白），这使基因组DNA严重降解。尽管可通过微型DNA条形码鉴定物种并拼凑重建一个或两个位点进行DNA zip编码，但这可能对某些基因组工作流程构成挑战，尤其是依赖限制性酶切和较长片段回收的简化代表测序方法。然而，专门的短读长测序方法通常可从降解材料中恢复基因组信息。本研究旨在确定全基因组靶向方法是否可用于评估供应全球贸易枢纽的干鱼翅的来源种群，使用已知含有高度降解DNA的市场来源鱼翅样本。研究人员使用了已有的牛鲨全球种群基因组数据集，其中1849个核SNP定义了六个分化种群，作为潜在种群来源的基线。在香港采集的干鱼翅修剪碎料（从加工鱼翅上切下的小块干组织，含肌肉、皮肤和软骨）作为市场样本。
二、研究内容与主要结论
本研究的目的是：（1）确定标准基因组工作流程和分析是否能从由东南亚典型加工鱼翅产品组成的市场样本中获得稳健的种群基因组数据；（2）初步了解供应全球最大干鱼翅枢纽的牛鲨鱼翅的主要捕捞区域。
研究结果表明，尽管材料高度降解，标准DArTcap基因组工作流程仍为大多数样本产生了足够数据，仅有限数量的文库构建失败（n=22）。SNP数据使大多数香港鱼翅修剪样本能够同时进行来源地和遗传性别鉴定（分别为133尾和138尾独立鲨鱼）。大多数样本被归属至IWP（71.4%）和W-ATL（22.6%）。遗传性别鉴定显示雄性数量约为雌性的两倍（2.21:1 M:F），但由于可靠鉴定雌性需要在多个X连锁位点存在杂合性，该方法存在偏向雄性鉴定的保守性偏差。本研究首次证明基因组数据可用于将未知来源的鲨鱼组织归属至其源种群，解决了鲨鱼贸易产品监测中长期存在的空白。
三、关键技术与方法
研究人员使用了以下主要关键技术方法：（1）DArTcap靶向测序技术，这是一种在DArTseq文库测序前增加杂交捕获富集步骤的方法，使用基于3410个探针（包括210个推定位于性染色体上的探针）设计的定制生物素化RNA MYbaits进行富集；（2）基于R包radiator的SNP calling与数据质量控制流程，对SNP位点评估重复性、次要等位基因计数（MAC）、覆盖度、检出率、SNP位置、连锁不平衡和哈迪-温伯格平衡（HWE），对个体样本评估缺失率、杂合度和重复检测；（3）判别主成分分析（DAPC），在adegenet中执行，用于区分各遗传群组并分配未知来源样本；（4）贝叶斯混合种群分析，在rubias中执行，基于马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）或参数自助法（10,000次迭代）进行来源地归属和混合比例估计；（5）主成分分析（PCA），用于可视化香港样本相对于参考样本的分布；（6）基于14个X连锁SNP标记的K-means聚类算法（dartR.sexlinked）进行遗传性别鉴定。样本来源为2014–2018年间从香港随机零售商户采集的160份牛鲨鱼翅修剪碎料，物种身份此前已通过多重微型条形码PCR扩增线粒体细胞色素氧化酶I基因的两个小扩增子（150–200 bp）确认。
四、研究结果
4.1 DNA提取、基因分型与质量过滤
由于鱼翅经过深度加工，大多数样本的DNA已降解（<600 bp），22个样本文库构建失败。所有151个文库（含13个技术重复）均产生测序数据，每个样本平均105,078条reads，8364个SNP的平均读序深度为9.2。经放宽的质量过滤后，保留了140个香港样本的2142个SNP（含7个技术重复）。11个香港样本（含6个重复）因高缺失数据、高杂合度和明显重复检测在个体水平过滤中被移除。许多香港样本仍具有高缺失数据（42个样本缺失数据>20%）和高杂合度（5个样本杂合基因型>10%）。主成分分析（PCA）显示，PC1解释了总遗传变异的44%，主要区分IWP与W-ATL和E-PAC种群，PC2将E-PAC与其余区域分开。在更精细的空间尺度上，PC4和PC6分别区分了日本和斐济种群，尽管每个轴解释的变异不足0.45%。
4.2 来源地和性别鉴定
判别主成分分析（DAPC）的后验分组鉴定（K=6；PCs=95）将所有样本归属至三个区域之一：E-PAC、W-ATL或IWP。rubias的MCMC和参数自助法分配结果相似，但DAPC归属至IWP的4个样本被报告为源自E-ATL。40个归属至IWP的香港样本在PCA空间中位于IWP和E-ATL之间的中间位置。rubias z-score近似正态分布，较低值与缺失数据显著相关（r=?0.41；p<0.001）。参考数据集的自分配准确率在DAPC和rubias中均很高（100%）。总体而言，大多数样本被归属至IWP（n=101–105，含6个重复）和W-ATL（n=31，含1个重复）。所有技术重复均被归属至相同的参考种群。
基于已知性别个体（n=853）的遗传性别鉴定显示，雌性被误判为雄性的概率为19.7%，雄性被误判为雌性的概率为10.5%。由于性别鉴定仅依赖14个X连锁标记，可在质量过滤前对更大样本子集（n=138个独立个体）进行。每个个体平均成功分型12.5个X连锁标记，但有些仅有3个标记。应用于香港样本时，遗传学鉴定出43个雌性和95个雄性。基于验证数据集中观察到的误判率，真实雌性和雄性数量估计分别在38.5–61.7和76.3–99.5尾之间。所有技术重复均被鉴定为相同性别。
五、讨论与结论
本研究首次证明基因组数据可用于将未知来源的鲨鱼组织归属至其源种群，解决了鲨鱼贸易产品监测中的长期空白。来源地鉴定准确率受到部分样本中大量缺失数据的影响，这归因于鱼翅在贸易前的深度加工（包括漂白和干燥）。然而，鉴于牛鲨强烈的全球种群结构，高水平的缺失数据并未损害该物种的种群水平归属。对于遗传分化较弱的物种，缺失数据可能对归属置信度产生不成比例的影响，应用类似基因组方法时需谨慎。此外，对于高缺失数据且匹配未采样或采样不足区域（如E-ATL）的样本，解释需谨慎。值得注意的是，rubias归属至东大西洋的4个样本均具有>47%的缺失数据和较差的模型拟合（低z-score），表明这些归属由数据丢失驱动而非真实的E-ATL来源。来源地归属的置信度得到两种归属分析（DAPC和rubias）之间的强一致性、PCA聚类的目视检查以及技术重复之间的完全一致性的支持。
基因组分析相比单位点方法提供了额外优势，即可使用X连锁SNP标记进行遗传性别鉴定。该方法存在偏向雄性鉴定的保守性偏差，因为在多个X连锁位点的杂合性是可靠雌性鉴定的必要条件。在市场层面，性别比估计显示雄性数量约为雌性的两倍（2.21:1 M:F）。当潜在性别比接近1:1时，即使相对较低的误判率也可能对推断的性别组成产生不成比例的影响。因此，此处报告的性别比应被解释为市场组成的宽泛指标而非精确的人口统计估计。
与单位点mtDNA方法相比，核SNP在来源地分析中具有多项优势，包括双亲遗传、位点间独立性和对同塑性及随机漂移的较低敏感性。以往的基于mtDNA的鱼翅贸易研究通常不对每个产品进行来源地归属，而是通过混合种群分析估计整个样本的种群贡献，且常具有较宽的置信区间。相比之下，本研究使用的方法对每个鱼翅产品进行来源地归属，并具有明确的定量数据质量度量（如缺失率和杂合度），这对处理降解的市场样本至关重要。然而，由于鲨鱼通常表现出强烈的雌性归家性和雄性偏向扩散，单位点mtDNA在某些情况下可能揭示比核SNP更精细的结构，从而具有更高的地理精度。但当DNA高度降解时，mtDNA分析需要非常短的扩增子，这可能加剧同塑性，特别是在常用于来源地归属的线粒体控制区。
研究发现大多数牛鲨鱼翅样本源自IWP（71.4%）和W-ATL（22.6%）。尽管市场采样时间与该物种被列入CITES附录II的时期不重叠，但与2024年（该物种被列入后的第一个完整年份）的CITES贸易数据库比较显示总体一致性。向香港出口牛鲨鱼翅的主要出口国来自IWP（斯里兰卡、印度尼西亚），其次是墨西哥（预计供应来自W-ATL和E-PAC的鱼翅）。未来研究将能够直接将市场样本的基因组归属与CITES贸易记录进行比较，以检测表明全球供应链内聚集点存在未记录因而非法贸易的差异。
本研究提供了概念验证，证明基因组方法可为支撑鲨鱼贸易的全球供应链提供可操作信息，即使是干制和漂白鱼翅等深度加工产品也是如此。实现该方法的全部潜力需要扩展CITES列名物种的全球种群基因组基线，具有全面的地理覆盖以最小化 ascertainment bias 并最大化归属准确率。此类基线将提高关于所涉供应链推断的空间精度，并实现常规、独立的贸易申报来源地核验。除来源地外，基因组学还可揭示贸易中的生物学意义模式，包括偏斜的性别比，这可能对具有性别偏向脆弱性或育幼场开发的物种提出额外的保护关切。目前，香港鲨鱼翅市场中交易的物种有三分之一面临灭绝威胁且渔业管理有限。将基因组监测整合入监管框架因此提供了一条强大、可扩展的路径，以改善可追溯性、支持CITES实施、检测未记录的贸易，并更好地使鲨鱼渔业开发与保护和管理目标保持一致。
