N-苄基肉桂酰胺通过Sigma-1受体相关应激信号通路在氧化应激与神经退行性变模型中发挥多机制神经保护作用

《Oxidative Medicine and Cellular Longevity》：Neuroprotective Effects of Two N-Benzylamides in Models of Oxidative Stress, Neurite Outgrowth and Neurodegeneration

　　

氧化应激是神经退行性疾病（neurodegenerative diseases, NDDs）的核心病理机制，可导致线粒体功能障碍、蛋白质稳态受损及进行性神经元丢失。Sigma-1受体（sigma-1 receptor, S1R）是一种内质网（endoplasmic reticulum, ER）驻留分子伴侣，负责协调细胞应激反应，已成为神经保护领域具有前景的治疗靶点。在本研究中，研究人员采用互补的体外、体内及计算机模拟方法，探究了结构相关的N-苄基酰胺类化合物——N-苄基肉桂酰胺（N-benzylcinnamide, NBCA）和N-苄基苯甲酰胺（N-benzylbenzamide, NBBA）的神经保护特性及其机制。研究人员首先利用谷氨酸诱导的HT22海马神经元氧化损伤模型和H₂O₂诱导的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞氧化应激模型评价其神经保护活性。两种化合物均能显著减轻氧化损伤，但NBCA始终表现出更强的保护效能，因此被选定用于深入的机制研究。NBCA能够降低细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生和脂质过氧化水平，同时恢复内源性抗氧化酶活性、线粒体膜电位、ATP生成及胆碱能稳态。免疫荧光分析表明，NBCA可调节氧化应激后核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）和S1R的免疫反应性。NBCA还能促进野生型（wild-type, WT）Neuro-2a细胞的神经突生长，而这些效应在S1R敲除细胞中完全消失，支持S1R相关信号通路的参与。分子对接预测NBCA与应激反应蛋白S1R、BiP和TMEM97之间存在有利的相互作用，提示其可能调节相互关联的细胞应激反应网络。在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）模型中，NBCA提高了线虫对氧化应激的抵抗力，保留了学习记忆功能，延缓了β-淀粉样蛋白诱导的瘫痪，并减少了转基因阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）模型中的淀粉样蛋白沉积。综上所述，这些发现表明NBCA通过维持氧化还原稳态、线粒体功能和神经元完整性，在多种实验模型中发挥神经保护作用。药理学、遗传学、影像学、计算模拟及整体生物水平证据的汇聚支持S1R相关信号通路参与NBCA的生物学活性。总之，这些研究结果证明，调节S1R相关的细胞应激反应网络是保护氧化应激和神经退行性变过程中神经元功能的一种有前景的策略，并确定NBCA可作为未来机制研究和治疗开发的重要先导化合物。

**论文解读**

**研究背景**

神经退行性疾病（neurodegenerative diseases, NDDs）以神经元结构和功能的进行性丧失为特征，最终导致不可逆的神经功能损害。尽管阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）、帕金森病（Parkinson's disease, PD）、亨廷顿病（Huntington's disease, HD）、肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）和路易体痴呆（dementia with Lewy bodies, DLB）等疾病的临床表现各异，但它们共享多种病理机制，包括氧化应激、线粒体功能障碍、蛋白质稳态受损、神经炎症及进行性神经元丢失。其中，氧化应激被认为是神经退行性变的核心驱动因素，可促进脂质过氧化、破坏线粒体功能、损害蛋白质稳态并激活凋亡信号通路，从而危及神经元存活。尽管对症治疗取得了一定进展，但有效的疾病修饰疗法仍然极为有限，亟需寻找能够保护神经元完整性和功能的新型分子靶点。

Sigma-1受体（sigma-1 receptor, S1R）因其在协调细胞应激反应中的核心作用，已成为NDDs领域备受关注的治疗靶点。S1R是一种内质网（endoplasmic reticulum, ER）驻留的配体操作性分子伴侣，富集于线粒体相关膜（mitochondria-associated membrane, MAM），可调节钙稳态、线粒体功能、蛋白质稳态及细胞对氧化应激的适应性反应。在细胞应激条件下，S1R调控包括核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）介导的抗氧化反应在内的多种细胞保护信号通路，从而促进神经元存活并维持神经元功能。S1R激动剂如blarcamesine（Anavex2-73）用于AD和pridopidine用于HD的临床开发，为这一治疗策略提供了概念验证。

N-苄基酰胺类化合物是一类具有中枢神经系统活性的生物活性分子。其中，N-苄基肉桂酰胺（N-benzylcinnamide, NBCA）是从胡椒属植物Piper submultinerve中分离的天然产物，既往研究显示其具有抗β-淀粉样蛋白诱导的神经元损伤的神经保护活性。然而，这些神经保护效应背后的分子机制尚不清楚。因此，研究人员纳入了结构相关的类似物N-苄基苯甲酰胺（N-benzylbenzamide, NBBA），以确定NBCA的神经保护特性是否可推广至其他N-苄基酰胺类化合物。阐明这些化合物作用的分子机制，将有助于理性开发针对AD及相关神经退行性疾病的新型治疗策略。该论文发表于《Oxidative Medicine and Cellular Longevity》。

**研究采用的关键技术方法**

研究人员采用多层次的实验策略系统评价NBCA和NBBA的神经保护作用及其机制。体外研究方面，使用HT22海马神经元细胞系（由美国索尔克研究所David Schubert博士馈赠）构建谷氨酸诱导的氧化损伤模型，使用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系（获自日本研究生物资源库JCRB）构建H₂O₂诱导的氧化应激模型；利用CRISPR/Cas9技术构建的S1R敲除（knockout, KO）Neuro-2a（N2a）细胞（由美国国立卫生研究院Tsung-Ping Su教授提供）进行神经突生长实验。体内研究方面，采用了多种秀丽隐杆线虫品系，包括野生型N2（Bristol）、β-淀粉样蛋白过表达的CL2006和CL4176转基因品系（获自美国明尼苏达大学线虫遗传中心CGC）以及S1R直系同源基因敲除品系TM3443（由日本国家生物资源项目提供）。计算机模拟方面，使用分子对接技术预测NBCA与S1R、BiP（结合免疫球蛋白/GRP78）及TMEM97（sigma-2受体）的相互作用。分析方法涵盖MTT细胞活力检测、H₂DCFDA荧光探针测定ROS、TMRE荧光检测线粒体膜电位、免疫荧光染色及ImageJ定量分析、抗氧化酶活性测定（超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPx、谷胱甘肽还原酶GR）、脂质过氧化TBARS检测、胆碱酯酶活性测定、β-半乳糖苷酶活性检测、化学趋化与学习记忆行为学实验、瘫痪试验及硫黄素S染色等。

**研究结果**

*NBCA和NBBA保护神经元细胞免受谷氨酸和H₂O₂诱导的氧化损伤*

在HT22细胞中，谷氨酸（5 mM）显著降低细胞活力，NBCA（100和500 nM）和NBBA均能显著减轻谷氨酸诱导的细胞毒性。在SH-SY5Y细胞中，H₂O₂（200 μM）同样显著降低细胞活力，NBCA在100、200和500 nM浓度下均能显著提高细胞活力，NBBA在500 nM时达到统计学显著的保护效果。两种化合物单独处理（100-500 nM）不影响细胞基础活力，但600 nM以上浓度出现细胞毒性。

*NBCA减轻氧化应激并恢复内源性抗氧化防御*

在SH-SY5Y细胞中，NBCA（100-500 nM）显著降低H₂O₂诱导的细胞内ROS产生和脂质过氧化水平，并在所有测试浓度下显著恢复SOD、GPx、GR和CAT的酶活性，最大效应出现在500 nM。

*NBCA保护线粒体功能并减轻细胞衰老*

NBCA（100-500 nM）显著恢复H₂O₂暴露后降低的线粒体膜电位（TMRE荧光检测）和细胞内ATP含量，并显著降低β-半乳糖苷酶活性（细胞衰老标志物）。

*NBCA调节H₂O₂诱导的氧化应激后胆碱酯酶活性*

H₂O₂处理显著降低乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）活性并升高丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase, BuChE）活性。NBCA在所有测试浓度下均能显著恢复AChE活性并降低BuChE活性至接近对照水平。S1R激动剂PRE084和拮抗剂氟哌啶醇（haloperidol）的药理学实验结果进一步支持了S1R相关信号通路的参与。

*NBCA增强氧化应激后NRF2相关的抗氧化反应*

免疫荧光分析显示，H₂O₂暴露显著增加NRF2免疫反应性，NBCA（500 nM）处理使其恢复至接近对照水平，PRE084产生类似效果。定量分析证实NBCA呈浓度依赖性降低NRF2免疫反应性，氟哌啶醇共处理减弱了NBCA的效应。同时，H₂O₂暴露显著升高S1R免疫反应性，NBCA（100-500 nM）以浓度依赖性方式显著降低S1R免疫反应性，PRE084产生相似效果，氟哌啶醇部分减弱NBCA的效应。

*NBCA通过S1R依赖性机制促进神经突生长*

在野生型Neuro-2a细胞中，NBCA和NBBA均能显著促进神经突生长，但该效应可被选择性S1R拮抗剂BD1047显著减弱。在S1R敲除Neuro-2a细胞中，NBCA和NBBA的促神经突生长活性完全消失。值得注意的是，未经处理的S1R敲除细胞表现出比野生型细胞更长的基底神经突长度。

*分子对接预测NBCA与S1R、TMEM97和BiP的有利相互作用*

分子对接分析显示，NBCA对S1R（?7.97 kcal/mol）、TMEM97（?10.10 kcal/mol）和BiP（?9.58 kcal/mol）均表现出有利的预测结合亲和力。NBCA在S1R结合口袋中采取了与已知配体PRE084和氟哌啶醇相似的结合取向，并与Glu172、Phe107、Thr181、Tyr103和Trp89等经典结合位点残基形成保守相互作用。

*NBCA和NBBA对线虫寿命影响有限*

Kaplan-Meier生存分析表明，NBCA在100-500 nM浓度范围内对野生型和CL2006转基因线虫的寿命均无显著影响。NBBA在100 nM时对CL2006线虫的中位寿命有适度但显著的延长作用。

*NBCA提高线虫氧化应激后的生存率*

在H₂O₂（200 μM）应激条件下，NBCA（100-500 nM）以浓度依赖性方式显著提高野生型线虫的生存率，200 nM时效果最佳，可恢复至接近未处理对照水平。PRE084同样改善生存，NBCA与PRE084联合使用产生了最高的中位生存率。

*NBCA通过S1R依赖性机制减轻氧化应激诱导的行为缺陷*

在野生型线虫中，慢性H₂O₂暴露逐步损害化学趋化、学习及短期关联记忆能力，NBCA显著保护这些行为功能，PRE084产生相似的改善效果，而氟哌啶醇共处理消除了NBCA的行为保护作用。关键的是，在TM3443 S1R敲除品系中，NBCA完全丧失了保护化学趋化、学习和短期记忆的能力，明确表明NBCA的行为保护作用依赖于功能性S1R的存在。

*NBCA保护AD线虫模型的行为表现*

在CL2006和CL4176转基因AD线虫品系中，NBCA（100-500 nM）显著改善化学趋化、学习及短期关联记忆行为表现，PRE084产生相似效果，氟哌啶醇减弱NBCA的保护效应。

*NBCA和NBBA减轻转基因线虫中Aβ诱导的瘫痪*

在CL2006品系中，未处理线虫的瘫痪率在第20天达到约55%，NBCA在所有浓度下显著延缓瘫痪发展，维持瘫痪水平接近野生型对照。CL4176品系中观察到相似的保护效果。NBBA同样降低瘫痪率，但效果总体上弱于NBCA。

*NBCA减少转基因线虫中β-淀粉样蛋白积累*

硫黄素S染色显示，未经处理的CL2006线虫体内存在大量淀粉样蛋白阳性沉积物。500 nM NBCA处理显著减少淀粉样蛋白沉积的数量和强度，效果与PRE084（100 nM）相似。

**讨论与结论**

本研究通过体外、体内和计算机模拟多种互补模型，系统证明了NBCA具有广泛的神经保护效应。讨论部分指出，NBCA能够保护神经元免受谷氨酸和H₂O₂诱导的氧化损伤，其保护作用不局限于单一氧化损伤机制。NBCA降低NRF2免疫反应性的发现，结合ROS和脂质过氧化水平显著降低以及抗氧化酶活性恢复的结果，表明NBCA可能通过早期抑制氧化应激，从而降低细胞对NRF2持续代偿性激活的需求。此外，NBCA恢复AChE活性并正常化BuChE活性的能力，提示其神经保护作用不仅限于维持细胞活力，还延伸至维持胆碱能神经递质调节通路的功能。

本研究提供了多条独立证据支持S1R相关信号通路参与NBCA的神经保护作用，包括药理学调控、免疫荧光分析、基因敲除模型和计算对接。其中，神经突生长实验提供了最强的功能性证据：NBCA和NBBA的促神经突效应在S1R拮抗剂存在下被显著减弱，并在S1R敲除细胞中完全消失。然而，讨论也坦诚指出了研究的局限性：直接受体结合实验尚未开展，尚不能确定NBCA是作为S1R的正构配体、别构调节剂还是通过调节上游细胞应激通路间接影响S1R信号；BiP和TMEM97的预测相互作用尚需实验验证；未来还需在哺乳动物神经退行性变模型中评估NBCA的药代动力学特性、脑组织暴露水平、长期疗效及治疗潜力。

**研究结论**：本研究表明NBCA在互补的细胞、整体生物和计算模型中发挥强大的神经保护作用。NBCA通过维持氧化还原稳态、保护线粒体功能、恢复内源性抗氧化防御和维持胆碱能酶活性来保护神经元免受氧化损伤。这些细胞效应伴随S1R相关应激反应的调节、神经突生长的促进以及在多种秀丽隐杆线虫氧化应激和AD模型中神经元功能的保护，同时伴有β-淀粉样蛋白积累的减少和瘫痪的延迟。药理学、遗传学和计算模拟证据的汇聚支持S1R相关信号通路参与NBCA的生物学活性，并提示其他细胞应激反应通路也可能对其神经保护作用有所贡献。尽管还需要进一步研究来确定其直接的分子靶点和药理学特性，但本研究将NBCA确定为一个有前景的神经保护先导化合物，为未来开发N-苄基酰胺衍生物作为AD及相关神经退行性疾病的治疗候选药物提供了坚实的基础。