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靶向呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白的新抗体已显著减少婴儿住院率1。然而，病毒耐药性令人担忧：一种抗体因耐药株而在临床试验中失败2，并且针对最广泛使用的抗体（nirsevimab）已发现散发性耐药突变3,4,
靶向呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白的新抗体已显著减少婴儿住院率1。然而，病毒耐药性令人担忧：一种抗体因耐药株而在临床试验中失败2，并且针对最广泛使用的抗体（nirsevimab）已发现散发性耐药突变3,4,5,6。本研究阐述了RSV F突变如何影响抗体中和。首先提供了一个生物物理模型，说明双价IgG结合的缓冲作用如何与nirsevimab对B亚型较低的Fab效价相结合，使得该抗体在B亚型中的耐药性比A亚型更常见。随后进行了假病毒深度突变扫描，以安全地测量几乎所有F突变对其细胞进入功能以及nirsevimab、clesrovimab和其他几种关键抗体的IgG和Fab形式中和的影响。这些测量结果用于对RSV序列进行实时监测以发现抗体耐药性，并表明耐药株虽零星出现但目前较为罕见。总体上，本工作展示了Fab效价和表位特异性如何共同决定病毒突变对抗体中和的影响，使得能够监测对公共卫生重要的抗体产生耐药性的自然RSV株，并有助于指导未来具有抗病毒逃逸能力的抗体的开发。
**论文解读：RSV F蛋白突变对抗体中和作用的系统性解析**
**一、研究背景与问题**
呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）是美国婴儿住院和全球婴儿死亡的主要原因。近期，两种靶向RSV融合蛋白（fusion protein, F）的单克隆抗体nirsevimab和clesrovimab被批准用于婴儿预防，其中nirsevimab对RSV相关住院的保护效力约为75–80%。然而，病毒耐药性问题随之而来：Regeneron公司的抗体suptavumab因循环RSV-B株中的逃逸突变而在III期临床试验中失败；nirsevimab使用中也已鉴定出散发的耐药突变，尤其在突破性感染中。尽管RSV F蛋白比流感病毒和SARS-CoV-2的表面蛋白变异慢，但仍以足够快的速度进化，对单克隆抗体构成挑战。因此，对RSV序列进行潜在逃逸突变的监测是重要的公共卫生优先事项。但既往研究仅通过将实验室适应株在抗体存在下连续传代，或在抗体结合足迹中寻找突变，只鉴定出有限的耐药突变，导致监测工作因缺乏F突变如何影响关键抗体的完整知识而受阻。本研究旨在提供F突变影响抗体的全面定量理解，并建立实时监测平台。
**二、研究内容与结论**
研究人员将双价IgG中和的生物物理模型与深度突变扫描（deep mutational scanning, DMS）相结合，测量了几乎所有氨基酸突变对F蛋白细胞进入功能及多种抗体IgG和Fab形式中和的影响。研究解释了为何nirsevimab耐药突变在B亚型中比A亚型更常见，定义了现有和候选临床抗体的逃逸潜力，并建立了能够快速识别抗体耐药自然RSV株的序列监测平台。结果表明，耐药株目前零星出现但总体罕见。该工作揭示了Fab效价和表位特异性如何共同决定病毒突变对抗体中和的影响，为监测具有公共卫生重要性的抗体耐药株及开发抗逃逸的新抗体提供了基础。
**三、主要技术方法**
研究人员使用假病毒深度突变扫描（pseudovirus deep mutational scanning）安全测量F突变效应——假病毒仅编码F蛋白，只能进行单轮细胞进入，不产生复制型病毒。研究中构建了两个独立的F突变假病毒文库，覆盖F胞外域近全部可能的氨基酸突变。同时建立定量生物物理模型，模拟双价IgG结合对降低Fab亲和力突变的缓冲作用。此外，将逃逸评分整合至基于Pathoplexus数据库超过60,000条RSV序列的Nextstrain系统发育树中，实现实时可视化监测。验证实验使用来自亚型A Long株（1950s分离）和亚型B B1株（1980s分离）的F突变假病毒，以及自然序列来源的F蛋白。抗体包括nirsevimab、clesrovimab、palivizumab、suptavumab、RSM01、1A2和1B6。
**四、研究结果**
**1. 双价IgG结合缓冲突变**
研究人员建立了双价IgG结合的生物物理模型，预测当Fab亲和力足够高时，降低亲和力的病毒突变不会明显降低IgG中和，因为双价结合使几乎所有IgG仍能结合突变病毒。实验验证发现，已知B亚型逃逸突变K68Q和(K/N)201S在A、B亚型中均降低Fab中和，但仅在B亚型中降低IgG中和。这解释了nirsevimab耐药突变在B亚型更普遍的原因——nirsevimab对A亚型F蛋白亲和力较高，双价IgG结合缓冲了突变影响；对B亚型亲和力较低，缓冲作用消失。
**2. F的功能约束**
深度突变扫描显示，F蛋白许多区域（包括融合肽）高度保守，大多数突变损害细胞进入功能。p27片段两端的切割基序碱性残基不耐受突变，而p27片段本身耐受突变。nirsevimab靶向的顶端表位比clesrovimab靶向的侧面表位更具突变耐受性。在广泛定义的抗原区域中，区域0最耐受突变，区域III和IV约束更强。自然RSV序列中相对于实验室适应株的大多数F突变对细胞进入影响很小。
**3. nirsevimab对F突变体的中和**
影响nirsevimab中和的突变位于64–73和201–216位点，均在或靠近其结构确定的结合位点。研究鉴定出多个新耐药突变，包括新位点67、73、206–207、210–211和215–216。DMS测量与传统中和实验高度相关（IC
50变化与DMS效应相关），且Fab测量比IgG测量更能跨亚型推广。研究发现N67T和K209Q是导致nirsevimab对B亚型Fab效价低于A亚型的关键序列差异。单个突变如N67T、K68Q、K201S和K209Q单独不降低A亚型IgG中和，但组合成双突变或三突变时显著降低IgG中和。
**4. clesrovimab对F突变体的中和**
影响clesrovimab中和的突变位于426–470位点，包括新位点426、429、433和470。DMS效应与传统中和实验在A、B亚型均高度相关。中等效应突变（如R429M/S）对Fab中和的降低大于IgG，表明双价IgG缓冲作用在clesrovimab对两个亚型均存在。与nirsevimab相比，减少clesrovimab中和的突变位点较少，部分原因是clesrovimab表位突变往往更严重损害细胞进入，导致无法测量中和影响。
**5. 表型信息化的RSV监测**
研究人员将逃逸评分（每个序列所有F突变的总和效应和单一最大效应）整合到Nextstrain系统发育树中，并用Pathoplexus最新序列数据更新。具有高nirsevimab或clesrovimab逃逸评分的序列少于1%且分布在树各处，表明耐药突变零星产生，尚未持续传播。验证实验显示，绝大多数高逃逸评分的自然序列确实表现出中和降低，包括含有新鉴定耐药突变的株（如K201I/E、R429S）。但有一个A亚型株例外，可能因S211R与R213S的上位效应导致预测失败。
**6. 历史与候选抗体**
suptavumab的深度突变扫描显示，影响其中和的主要是173和174位点。自2015年起L172Q和S173L在B亚型中流行，这是其III期临床试验失败的原因。palivizumab耐药突变位于255–277位点。候选抗体RSM01的耐药突变位点位于68–80和202–216，与nirsevimab部分重叠但不完全相同。1B6的耐药突变位点位于F顶端，但与其他顶端抗体（nirsevimab、RSM01）大部分不同。1A2的耐药突变位点与clesrovimab重叠，但单个突变很少强烈降低1A2中和，可能因其极高亲和力赋予强健性。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，与传统的连续传代耐药筛选相比，深度突变扫描具有两个优势：全面表征所有突变，而非仅随机出现的突变；不产生具有复制能力的病毒突变体。但传代能发现组合突变，而DMS只测单突变效应。实际上，DMS识别了所有既往传代研究发现的耐药突变，还发现了新突变。单基因背景的限制被生物物理模型部分克服——亚型依赖性效应主要由双价IgG结合缓冲解释。研究建立的实时监测平台和交互式网络资源将支持对现有及新开发抗体的持续评估。目前耐药罕见，但可能像oseltamivir耐药一样传播。耐药传播可能因附带优势（如增强传播力或逃逸群体免疫）而发生，也可能因抗体使用产生的直接选择压力。由于无法精确测量传播力，持续监测和开发具有不同耐药谱的新抗体是最佳策略。
研究结论可翻译为：本研究展示了Fab效价和表位特异性如何共同决定病毒突变对抗体中和的影响，使得能够监测对公共卫生重要的抗体产生耐药性的自然RSV株，并有助于指导未来具有抗病毒逃逸能力的抗体的开发。
