转移性膀胱癌致死亚型的进化与异质性

《Nature》：Evolution and heterogeneity of lethal metastatic bladder cancer subtypes

　　

组织学变异是转移性尿路上皮癌（metastatic urothelial cancer）的一个预后特征，但其进化轨迹尚不明确。研究人员开发了一个富集组织学亚型的转移性膀胱癌（metastatic bladder cancer, BLCA）快速尸检项目，对终末期疾病个体进行剖析。通过重建患者肿瘤的进化历史，研究人员发现转移灶间播种（metastasis-to-metastasis seeding）是癌症扩散的主导模式，且多克隆迁移（polyclonal migration）增加预示着不良预后。基因组改变的负荷、异质性和时序在不同组织学亚型之间存在显著差异。浆细胞样（plasmacytoid）和神经内分泌（neuroendocrine, NE）变体早期即出现驱动改变，并与较短生存期相关。突变特征分析和实验模型表明，浆细胞样肿瘤独特地利用范可尼贫血（Fanconi anaemia, FANC）通路来减轻化疗诱导的基因组瘢痕形成。单核图谱分析（Single-nucleus profiling）揭示了组织学亚型中的混合细胞状态，以及转录异质性与患者生存之间的关联。肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）的特征描述发现了不同亚型间的免疫状态差异，其中浆细胞样肿瘤呈现免疫炎症谱，而鳞状肿瘤则主要表现为免疫抑制。最后，研究人员证明死后游离DNA（post-mortem cell-free DNA, cfDNA）能够捕获各亚型的基因组和转录异质性，这为非侵入性评估肿瘤特性和侵袭性提供了一种潜在策略。这些结果为肿瘤异质性如何塑造膀胱癌组织学亚型疾病进展的进化历史提供了新见解。

论文解读文章

研究背景与目的

转移性膀胱癌（metastatic bladder cancer, BLCA）是一种常见且高度致命的疾病，其显著的形态学和分子异质性给临床治疗带来巨大挑战。约四分之一的转移性BLCA患者肿瘤表现出亚型组织学特征，如鳞状分化（squamous differentiation）、浆细胞样（plasmacytoid）、神经内分泌（neuroendocrine, NE）或肉瘤样（sarcomatoid）分化。这些组织学亚型通常比传统尿路上皮癌（conventional urothelial carcinoma, UC）具有截然不同的疾病轨迹和对治疗的反应。然而，人们对于这些肿瘤中基因组、转录组和微环境异质性如何演变，以及如何塑造其独特的自然史和治疗反应，仍知之甚少。绘制患者体内转移性肿瘤的进化历史，可以揭示耐药克隆的出现并识别最佳的干预时机。但目前，针对组织学亚型中肿瘤进化和分子异质性的全面表征仍然有限，尤其是在转移背景下。

研究方法概述

研究人员建立了华盛顿大学-弗雷德哈钦森癌症中心（University of Washington and Fred Hutchinson Cancer Center, UW-Fred Hutch）转移性BLCA快速尸检项目，从20名尿路上皮癌患者中收集了104份肿瘤样本（包括8份原发肿瘤和80份转移灶）。研究采用全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）和全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）对93份肿瘤进行分析，并结合批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）以及循环游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）测序。同时整合了详细的临床病史、影像学、病理学和生存数据。

研究结果

频繁的转移灶间播种

基于体细胞突变分析重建系统发育关系和转移播种模式。在16例拥有高质量原发肿瘤的患者中，56%（9/16）的患者由一个早期转移灶播种了所有其他转移灶，而原发肿瘤作为主导播种者的占31%（5/16）。81%（13/16）的患者至少发生一次转移灶间播种事件。所有16例患者均观察到多克隆播种（polyclonal seeding），其中75%（12/16）涉及多系迁移（polyphyletic migration）。播种的多克隆性与增加的死亡风险呈正相关趋势（HR=6.8, P=0.09），并能改善生存风险分层（log-rank P=0.0007）。非UC组织学的肿瘤相比UC肿瘤具有更高比例的多系事件（P≤0.04）。免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor, ICI）治疗后出现的肿瘤由更多迁移克隆播种（P=0.11）和多克隆多系事件（P=0.029）。

创始突变先于结构改变

在128个已知BLCA相关基因中，共鉴定出143个致病突变、165个拷贝数改变（copy number alterations, CNAs）和40个结构变异（structural variants, SVs）断点。致病事件在所有改变类型中均早于非致病事件获得。致病突变在创始克隆（founder clones）中富集程度更高（中位数68.3%），显著高于CNA或SV事件（中位数33.3%和6.2%，P<0.040），表明较大的基因组改变可能晚于突变获得。所有20例患者均有晚期亚克隆致病改变导致患者内异质性。复杂结构变异（complex SVs）共142个，仅14%被归类为早期创始事件，但大多数SV破坏的BLCA相关基因（23/33，69%）由创始复杂SVs切断。

早期改变驱动PUC和NE肿瘤

基因组改变的负荷、异质性和时序在不同组织学亚型间差异显著。浆细胞样尿路上皮癌（plasmacytoid urothelial carcinoma, PUC）肿瘤编码突变负荷最高，而UC伴鳞状分化（UC with squamous differentiation, UCSD）和UC肿瘤分别具有中等数量的CNAs和SVs。PUC和NE肿瘤患者在创始克隆中显示出显著更高比例的致病改变，而UC或UCSD肿瘤则在早期和晚期克隆间分布均匀。这与组织学相关的驱动因子（如PUC中的CDH1、TP53和RB1，NE中的TP53、PTEN和RB1）的频繁创始改变相对应。PUC和NE肿瘤中更高的创始CNA比例与更短的生存期相关。

顺铂特征见于UC而非PUC肿瘤

主要的突变过程包括时钟样衰老（SBS1+SBS5）、APOBEC（SBS2+SBS13）和铂类化疗（SBS31+SBS35）。时钟样和APOBEC介导的突变过程富集于创始克隆（P≤0.039），而铂类化疗和DNA修复缺陷诱导的突变在共享和私有克隆中增加（P≤0.042）。PUC肿瘤在共享和私有克隆中显示显著更低的比例和总负荷的铂诱导突变（P=0.009），尽管顺铂暴露相似。

范可尼贫血通路驱动顺铂耐药

PUC肿瘤中有限的SBS31+SBS35突变特征不能用常见耐药机制的表达水平变化来解释。然而，范可尼贫血（FANC）通路组分在PUC中表达趋势更高（P=0.071），且FANC通路表达增加与SBS31+SBS35比例降低显著相关（ρ=-0.7, P=0.024）。独立队列中也观察到类似相关性。在BLCA细胞系实验中，高FANC表达的细胞系在顺铂处理后显示增加的泛素化FANCD2（P=0.009）和顺铂耐药性（平均IC50值13.2 vs 6.1 μM, P=0.004）。敲低FANCF后，SW780细胞显示降低的泛素化FANCD2和增加的顺铂敏感性；过表达FANCF则产生相反效果。

snRNA-seq揭示亚型异质性

通过批量RNA-seq将肿瘤分类为共识分子亚型，发现>90%的UCSD和UC-肉瘤样（UC-Sarc）肿瘤为基底/鳞状（basal/squamous, Ba/Sq）亚型，71%的NE肿瘤为NE样。UC肿瘤分为管状乳头状（luminal papillary, LumP）（32%）或Ba/Sq（51%）。PUC肿瘤分布于四个亚型，转移灶主要为管状不稳定型（luminal unstable, LumU）（62%），而原发肿瘤则为基质丰富型。单核RNA测序鉴定了不同的上皮、免疫和基质细胞区室。PUC样本在上皮区室中显示增加的细胞周期和DNA修复通路表达，包括高FANC。UCSD肿瘤显示增加的上皮间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）信号。患者内转录异质性增加与从首次转移开始的生存期延长相关（R2=0.60, P=0.041）。

PUC与UCSD的免疫状态差异

PUC肿瘤在淋巴结转移中具有最高比例的B细胞和T细胞（中位数29% B细胞和15% T细胞），呈现免疫炎症状态，富含B细胞和细胞毒性CD8 T细胞。UCSD肿瘤富含成纤维细胞和髓系细胞，主要由MRC1?肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages, TAMs）组成，包括SPP1? TAMs，指示免疫抑制环境。细胞间配体-靶标相互作用分析确定TGFB1是与PUC和UC-UCSD T细胞差异最相关的配体。PUC肿瘤的上皮和成纤维细胞中TGFB1表达降低，导致T细胞中TGFB1靶标活性低。UCSD肿瘤富集基质成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）阳性的基质癌相关成纤维细胞（matrix cancer-associated fibroblasts, mCAFs）。

cfDNA捕获几乎所有驱动SNV

cfDNA肿瘤分数（tumour fraction, TFx）中位数为5.9%，在伴有3个以上肝转移的患者中升高（P=0.0004）。高TFx样本（≥8%）中，cfDNA捕获了中位数70%的所有肿瘤单核苷酸变异（single nucleotide variants, SNVs），几乎所有的创始SNV（中位数98-100%）、79-90%的共享SNV和28-32%的私有SNV。几乎所有的BLCA驱动SNV（中位数93-100%）在高TFx cfDNA样本中被检测到。BLCA驱动基因的CNA同样在cfDNA WGS中得到良好捕获（总体中位数83%），创始增益和缺失的检出率分别为94%和100%。

cfDNA反映亚型转录活性

从cfDNA WGS数据的核小体占用分析揭示了不同肿瘤亚型间的差异转录活性。NE标记物ASCL1和SOX2的转录因子活性仅在患有NE肿瘤的患者中增加。HES1的低活性仅见于PUC患者，与其在PUC肿瘤中表达降低一致。cfDNA能够区分管状型和基底型UC/UCSD肿瘤，RARG、GRHL2和PPARG在LumP亚型中活性增加，而HMGA1在Ba/Sq亚型中活性增加。

讨论与结论

本研究对一个独特的BLCA快速尸检项目进行了全面的多组学分析，该项目包含了广泛的转移性BLCA组织学亚型。基因组进化分析揭示，转移灶间播种是转移性BLCA扩散的主导模式，这与来自其他癌症的报告一致。CT扫描证实了转移播种模式，但不能排除早期播种的微小转移灶。复杂播种与较差的生存期、变异组织学和免疫治疗相关。研究结果表明，对寡转移性疾病进行早期干预可能有助于抑制转移灶间传播，限制高度流行的多克隆进化并延长生存期。

基因组系统发育分析揭示了PUC和可能的NE亚型中创始驱动改变的富集，这可能解释了它们侵袭性的病程。然而，每位患者都存在非创始驱动因子，这表明单样本分析可能会遗漏构成耐药机制的晚期事件。观察到近期描述的BLCA中晚期铂类化疗突变特征在PUC肿瘤中减少，并与增加的FANC通路表达相关。BLCA细胞系实验表明，高FANC表达足以降低对顺铂的敏感性，这提示靶向FANCD2去泛素化（如使用USP1抑制剂）可能具有临床意义，以破坏FANC通路并使PUC肿瘤对化疗敏感。

结果揭示了分子和组织学亚型的异质性。PUC肿瘤已知为管状型，但研究发现PUC转移灶为LumU，而原发肿瘤为基质丰富型，突出了进化进程和基质在早期疾病中的作用。此外，即使只有少量鳞状分化的患者也往往具有完全Ba/Sq的肿瘤，表明最小程度的变异组织学可能具有患者范围的重大意义。