视黄酸（RA）自我调控环路调控前额叶-运动皮层区域化（Prefrontal–Motor Arealization）的机制研究

《Nature》：A retinoic acid autoregulatory loop governing prefrontal–motor arealization

　　

摘要专业翻译 额叶由前额叶联合皮层（PFC）和运动皮层（MC）构成，前者支持复杂认知与目标导向行为，后者执行运动功能。沿感觉运动-联合皮层轴建立不同的区域特性与连接，为皮层区域组织与功能提供了基础框架。视黄酸（RA）信号已被证实是PFC发育的关键调控因子。然而，RA信号在发育中的PFC内被空间限制的机制，以及其下游的RA响应基因网络，仍知之甚少。本研究在发育中的人类PFC中定义了一个RA相关基因调控网络（RA-GRN），并鉴定出与智力障碍和自闭症谱系障碍相关的转录因子编码基因MEIS2为该网络的关键枢纽。在小鼠皮层有丝分裂后兴奋性神经元中条件性敲除Meis2，导致前额叶联合皮层区域向运动样分子及连接特征的局部重特化，凸显了有丝分裂后神经元在建立和维持皮层区域特性中的关键作用。伴随Meis2缺失，表达RA合成酶ALDH1A3的兴奋性神经元群体，以及RA信号本身，在发育中的内侧前额叶皮层（mPFC）中显著减少。这些发现揭示了一个保守的自我调控环路：RA→MEIS2→ALDH1A3→RA，该环路强化了PFC富集的RA梯度，并组织MC–PFC轴。综上，研究结果揭示了一种有丝分裂后机制，通过该机制，神经元特性的特定特征强化RA信号，以定义前额叶和运动皮层区域的关键特征，将经典形态发生素与转录特性、神经环路形成及功能联系起来，并可能关联神经精神疾病。

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一、研究背景与科学问题

大脑额叶由前额叶联合皮层（PFC）和运动皮层（MC）构成，前者支持复杂认知、决策、抽象思维及人格等高级功能，后者负责运动执行。在灵长类中，PFC相对于运动皮层和感觉皮层显著扩张，这一扩张被认为与行为复杂性的增加和高级认知功能的涌现密切相关。因此，阐明PFC与MC沿感觉运动-联合皮层轴的区域特化机制，对于理解PFC扩张的演化与发育基础至关重要。

既往研究确立了皮层早期模式形成由转录因子和形态发生素信号中心的拮抗梯度所调控，随后受丘脑皮层轴突的指导性影响。然而，沿感觉运动-联合皮层轴建立区域特性的机制仍不清楚。视黄酸（RA）信号已被证实是PFC发育的关键调控因子：RA相关基因在发育中的内侧额叶边缘皮层和PFC中富集，且RA信号的改变可破坏小鼠内侧额叶及PFC的基因表达与发育。在人类中，RA通路组分的遗传变异与神经发育障碍（NDD）和精神分裂症（SCZ）相关。然而，RA信号在发育中的PFC内被空间限制的机制，以及其下游的RA响应基因网络，仍知之甚少。研究人员据此假设，通过构建RA相关基因调控网络（RA-GRN）并功能研究其关键枢纽基因，可揭示在皮层区域特性建立与稳定过程中发挥作用的调控层面。

二、研究内容与主要发现

1. 人类中胎期前额叶RA-GRN的构建

研究人员采用整合性多组学策略，在人类中胎期（受孕后13–24周，PCW13–24）背外侧前额叶皮层（dlPFC）中构建RA-GRN。首先，通过单核多组学（sn-multiome）技术获得配对单核RNA测序（snRNA-seq）与单核转座酶可及染色质测序（snATAC–seq）数据，并应用SCENIC+推断dlPFC基因调控网络。其次，通过CUT&Tag技术生成RA受体RARA、RARB、RXRG及活性调控/转录表观标记（H3K4me3、H3K27ac）的全基因组结合图谱。最后，整合上述数据与BrainSpan数据库中人类PFC富集基因，构建出推定的人类中胎期dlPFC RA-GRN。

加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定出五个主要RA相关基因模块，其中红色模块在中胎期高表达，富集前脑发育和轴突相关过程；蓝色模块呈渐进性发育增加，富集突触相关过程。两模块均与自闭症谱系障碍（ASD）、SCZ和NDD风险基因显著关联，且与SCZ和注意力缺陷多动障碍（ADHD）的常见变异显著富集。网络拓扑分析鉴定出多个高度连接的枢纽基因，其中MEIS2作为红色模块的关键枢纽，具有最强的PFC富集并与ASD相关。MEIS2编码高度保守的TALE类同源盒转录因子，其杂合破坏与ASD和神经发育延迟在全基因组水平显著相关。

2. RA直接调控MC–PFC轴上的MEIS2表达**

研究人员表征了MEIS2的跨物种时空表达模式。免疫组化（IHC）分析显示，人类PCW18、猕猴PCD80和PCD149及小鼠PD7中均存在保守的MC–PFC梯度，PFC中MEIS2蛋白富集。sn-multiome和IHC分析显示MEIS2在神经元谱系中表达，并在mPFC的SATB2?兴奋性上层神经元中显著富集。RAR–RXR CUT&Tag数据显示RA受体直接结合人类MEIS2启动子，荧光素酶实验证实RARB–RXRG异二聚体通过小鼠Meis2启动子协同激活转录。Rarb/Rxrg双敲除脑中Meis2表达显著降低。人类背侧大脑类器官经30天RA处理后，神经元中MEIS2显著上调。这些结果支持RA信号直接调控MEIS2表达，将其定位为RA信号沿MC–PFC轴的关键下游效应因子。

3. Meis2缺失破坏MC–PFC轴的区域化

研究人员利用Nex1-cre在皮层有丝分裂后兴奋性神经元中条件性敲除Meis2（Meis2-cKO小鼠）。形态测量分析显示额叶联合区域显著缩小。PFC标志物Cbln2和Plxnc1在cKO皮层中几乎缺失，而MC标志物Cyp26b1和Etv5从外侧运动皮层（ALM）和M2区域向内侧扩张至mPFC区域，初级体感皮层（SSp）标志物向前扩张至M1/2区域。这些结果支持Meis2缺失导致mPFC分子特性部分丧失，伴随ALM和M2向mPFC内侧移位及M1和体感皮层前向扩张。

连接性分析显示，Meis2-cKO小鼠mPFC至内侧丘脑核团（MD、VM）和杏仁核（AMY）的投射显著减少，而至脊髓的投射增加。逆行示踪证实CST投射神经元纵向扩张至喙侧和内侧PFC。这些发现表明mPFC区域获得或保留了成熟MC而非PFC的关键长程CST连接特征。行为学分析显示，Meis2-cKO小鼠筑巢行为显著受损，旷场实验中中心探索减少（提示焦虑样行为增加），运动活动显著增加。

4. Meis2通过ALDH1A3塑造MC–PFC轴的RA梯度

Meis2-cKO小鼠中，喙侧胼胝体（CC）投射几乎缺失，标记重定向至同侧皮层，喙侧CC和前连合显著减小，而大脑脚（CST投射主要通道）标记增加。值得注意的是，在17例携带MEIS2杂合破坏性变异且有临床详情的病例中，两例描述为CC变薄。伴随Meis2缺失，表达RA合成酶ALDH1A3的兴奋性神经元群体及RA信号本身在发育中的mPFC中显著减少。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：整合性多组学策略构建RA-GRN，包括单核多组学（sn-multiome）技术获得配对snRNA-seq和snATAC–seq数据并应用SCENIC+推断基因调控网络；CUT&Tag技术生成RA受体及表观标记的全基因组结合图谱；利用BrainSpan数据库（https://www.brainspan.org/）鉴定PFC富集基因；WGCNA进行基因模块分析；条件性基因敲除小鼠模型（Nex1-cre介导的Meis2条件敲除）；免疫组化（IHC）和原位杂交（WISH）分析蛋白和RNA表达；病毒介导的顺行和逆行神经示踪（AAVag-CAG-tdTomato和AAVrg-CAG-tdTomato）；人类背侧大脑类器官培养及RA处理；荧光素酶报告基因实验。样本来源包括人类中胎期（PCW18）尸检标本、猕猴PCD80和PCD149脑组织、小鼠各发育阶段脑组织。

四、研究结论与意义

本研究揭示了RA→MEIS2→ALDH1A3→RA的保守自我调控环路，该环路强化了PFC富集的RA梯度并组织MC–PFC轴。研究发现，有丝分裂后皮层兴奋性神经元通过MEIS2维持ALDH1A3表达和RA信号，进而维持PFC区域特性，防止其向运动样特性转变。这一机制将经典形态发生素RA与转录特性、神经环路形成及功能联系起来，为理解皮层区域化的有丝分裂后调控机制提供了新范式。MEIS2与ASD、NDD的遗传关联提示该环路可能参与神经精神疾病的发病机制，为相关疾病的机制研究和潜在干预靶点提供了新方向。该研究发表在《Nature》期刊。