球磨辅助天然低共熔溶剂高效回收微藻生物质中叶黄素的方法研究

《Results in Chemistry》：Efficient ball milling assisted approach to recover lutein from microalgae biomass with natural deep eutectic solvents

　　

研究人员开发了一种高效且环境友好的球磨辅助提取方法。天然低共熔溶剂（NADES）在从微藻生物质中回收叶黄素方面表现出优异的性能。研究人员选取了复合溶剂体系NADES:EtOH（50% vv^?1），该体系显示出更好的叶黄素稳定性。

叶黄素（lutein）是类胡萝卜素中叶黄素家族的一员，存在于微藻和植物中，可作为饲料和食品添加剂，并具有高抗氧化活性及潜在健康效应。传统主要来源万寿菊（Tagetes marigold）的生产受季节性、土地和水资源需求以及花瓣分离劳动成本限制。微藻具有生长快、适应性强、营养需求低、可全年采收等优势，并能固定二氧化碳，因此被视为可持续替代来源。然而，目前从微藻生物质中回收叶黄素多用四氢呋喃、丙酮、乙醚等有机溶剂，这些溶剂易燃、易挥发、不可生物降解且有毒；超临界二氧化碳法能耗高，离子液体（ionic liquids, ILs）合成复杂且不可生物降解，均不适用于大规模应用。此外，叶黄素稳定性差，易受光、热、氧等因素影响，热处理还会导致其异构化为9-顺式和13-顺式叶黄素。因此，亟需开发既能提高提取效率又能保持叶黄素稳定性的可持续方法。本研究提出一种高效、可持续的球磨辅助天然低共熔溶剂（NADES）提取方法，用于从蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）中回收叶黄素。

研究人员以购自云南保山泽源微藻健康科技有限公司的C. pyrenoidosa粉末为原料，采用物理混合加热法制备6种疏水性NADES，利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认合成。通过行星式球磨机对生物质进行预处理，优化球磨时间、转速和料球比；采用固液萃取（SLE），筛选NADES类型，并优化料液比和NADES:乙醇比例；使用高效液相色谱（HPLC）定量叶黄素；通过扫描电镜（SEM）和BET比表面积分析观察细胞破碎效果；通过热降解动力学、半衰期及热力学参数（活化能、焓、熵、吉布斯自由能）考察叶黄素稳定性；使用石墨化碳黑（GCB）固相萃取柱回收复合溶剂；采用绿色分析程序指数（GAPI）评估方法绿色性。

3.1 合成的NADES表征：FTIR显示氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）间存在分子间氢键，如胸腺酚羟基振动从3175.10 cm^?1移至3418 cm^?1，癸酸羰基带移动，证实低共熔混合物形成。密度为0.90–0.94 g/cm³，粘度11.67–98.40 mPa·s，表观pH随HBD比例增加而降低。

3.2 球磨条件对细胞破碎的影响：随着时间增加，叶黄素含量从0.61 mg/g增至30 min时的1.89 mg/g，之后下降；转速从200 rpm增至400 rpm，含量升至2.02 mg/g，500 rpm时下降；料球比从1:15增至1:30时含量升至2.02 mg/g。确定优化条件为30 min、400 rpm、1:30。

3.3 球磨预处理后表面和结构表征：SEM显示预处理细胞破裂、皱缩，未处理细胞完整。BET结果显示预处理生物质比表面积从4.13 m²/g增至7.30 m²/g。

3.4 不同NADES对提取叶黄素的评价：筛选了6种NADES，效率排序为N3 > N6 > N4 > N2 > N5 > N1；N3（胸腺酚:异冰片醇，1:1）效果最佳，产量高于传统溶剂乙酸乙酯（1.62 mg/g）。含酸性组分的NADES提取液呈淡黄色，归因于脱镁叶绿素化。

3.5 固液萃取工艺条件的改进：最佳料液比0.067 g·mL^?1，得到2.02 mg/g；最佳NADES:EtOH比例为50% vv^?1，含量达2.34 mg/g；三次萃取循环中，第一次循环提取量最高。

3.6 复合溶剂（NADES:EtOH）的回收：采用GCB固相萃取柱回收，循环三次的相对提取效率分别为88.40%、82.46%、70.89%；从柱上洗脱回收叶黄素的效率为56.41%。

3.7 叶黄素化合物的稳定性：在40、60、80°C下加热150 min，NADES:EtOH（50% vv^?1）中叶黄素降解率均低于甲醇对照，半衰期更高，如40°C时608.02 min对450.33 min。动力学表明活化能更高（18.73 kJ·mol^?1对11.79 kJ·mol^?1），ΔH为正，ΔG为正，说明降解是吸热、非自发过程。

3.8 方法绿色性评估：GAPI评估显示，NADES方法有6个绿色、7个黄色、2个红色区域，而传统有机溶剂方法为3个绿色、8个黄色、4个红色区域，表明NADES方法更环保可持续。

讨论部分：研究人员讨论了NADES的理化性质（粘度、密度、pH）对提取效率的影响，指出高粘度会降低传质。乙醇的加入降低了粘度，提高了叶黄素溶解度。NADES中氢键和疏水相互作用有助于保护叶黄素，防止降解。回收实验表明NADES可重复使用至少三次，具有经济性。绿色评估进一步支持该方法作为传统有机溶剂的替代方案。

结论部分：本研究提出了一种绿色、可持续的方法，在温和条件下使用NADES从蛋白核小球藻中回收叶黄素。据研究人员所知，本研究所用的NADES体系此前未见报道。通过降低NADES/EtOH（50% vv^?1）的粘度，提高了叶黄素回收率。所选溶剂在固液萃取中表现出在不同储存温度和时间内对叶黄素的最佳稳定性。研究结果凸显了NADES相较于乙酸乙酯的优越性能，并强调了其作为常规有机溶剂替代品从微藻中提取高附加值化合物的潜力。