《npj Aging》：Deciphering senescence-associated mechanisms through cell painting & transcriptomics
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衰老（senescence）是多种慢性疾病的关键病理机制，但也具有高度异质性。在本研究中，研究人员证明，高内涵成像（high-content imaging）与转录组学（transcriptomics）可共同阐明体外衰老（senescence in vitro
衰老（senescence）是多种慢性疾病的关键病理机制，但也具有高度异质性。在本研究中，研究人员证明，高内涵成像（high-content imaging）与转录组学（transcriptomics）可共同阐明体外衰老（senescence in vitro），区分复制性衰老（replicative senescence）与化学诱导衰老（chemically induced senescence），将其与静息状态（quiescence）区分开来，并刻画衰老细胞清除应答（senolytic response）。
细胞衰老（cellular senescence）是多种慢性疾病（如癌症、代谢功能障碍相关脂肪性肝炎[MASH]和特发性肺纤维化[IPF]）的共同病理机制，表现为不可逆的细胞周期阻滞。已知衰老标志包括溶酶体β-半乳糖苷酶活性升高、核仁增大、染色质重组、衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）和表面组（surfaceome）。然而，衰老具有高度异质性，不同细胞类型、状态和诱导物下表型差异很大。更好地理解这些差异，尤其是正常衰老与疾病相关衰老的区别，以及差异性的衰老细胞清除应答，有助于开发更具靶向性的衰老治疗药物（senotherapeutics）。为此，研究人员将高内涵成像（Cell Painting, CP）与转录组学相结合，在体外解析衰老的异质性。
### 关键方法
研究人员从Lonza购买原代人真皮成纤维细胞（dermal fibroblast, DF）和原代人肺成纤维细胞（lung fibroblast, LF），以晚期传代（late passage, LP）细胞作为复制性衰老基准，用博来霉素、帕博西尼、诺考达唑诱导衰老，用雷帕霉素诱导静息样状态，并以navitoclax（ABT-263）干预。主要方法包括活细胞成像与SA-β-GAL染色验证衰老；Cell Painting（CP）高内涵成像获取单细胞形态学特征；RNA-seq转录组分析；MOFA整合形态学与转录组数据。
### 模型验证与实验设计
研究人员通过传代接近Hayflick极限获得LP细胞，并以低血清作为LF中LP的替代性模型。化学诱导物中，2天博来霉素、5天帕博西尼和2天诺考达唑被选为模拟LP衰老的条件；雷帕霉素因撤药后可迅速恢复增殖而被作为静息样对照。衰老样特征通过活细胞成像确认低增殖能力，并以LP细胞为基准比较SA-β-GAL表达和细胞面积。
### CP形态学聚类揭示衰老、静息与衰老细胞清除应答相关细胞群
CP数据分析在细胞水平质控后去除12.4%的物体（死细胞和技术伪影），使用主成分分析（PCA）显示衰老样处理组与其他组沿PC1分开，且按化学诱导物而非衰老细胞清除药物分组。单细胞聚类在DF和LF中分别鉴定出多个形态学不同的细胞群，并找到4对跨细胞类型匹配的细胞群。DF4/LF4主要分布于衰老条件，呈现细胞增大、核增大而核染色强度降低；DF1/LF5富集于对照组，常见双核重叠；DF7/LF6具有明显线粒体特征，富集于雷帕霉素处理；DF6、DF8和LF7的丰度随navitoclax剂量增加，提示与凋亡或分裂相关。活细胞成像显示衰老细胞清除药物后核数目增加，但反应因细胞类型和诱导物而异，例如帕博西尼诱导的DF衰老对navitoclax无核数目改变。该部分表明，仅CP数据即可捕获增殖、静息、衰老及衰老细胞清除应答的形态学特征。
### 转录组学验证衰老特征并揭示体内外差异
转录组PCA沿PC1将衰老样条件与其他条件分开。研究人员将各处理与对照比较的差异表达与Hernandez-Segura等建立的体外成纤维细胞衰老特征进行相关分析，发现LP、帕博西尼和博来霉素条件与该特征高度一致；SenMayo体内衰老基因集仅部分富集于化学诱导衰老条件，而未富集于LP，并且LF对照经navitoclax处理后也出现富集，提示体内外衰老存在差异。细胞因子表达在LP、化学诱导衰老和静息状态之间各异；纤维化标志物只在LP中部分升高；衰老条件下CDKN1A和MKI67表达模式符合预期，而CDKN2A未出现预期变化。这些结果在分子水平刻画了衰老样表型，并说明体外系统的局限性。
### MOFA整合揭示共享与特有的衰老相关因子
为将形态变化映射到生物学过程，研究人员用多组学因子分析（Multi-Omics Factor Analysis, MOFA）整合CP和转录组数据，并在DF和LF中分别得到潜在因子；依据跨条件活性相关系数大于0.5匹配出5对因子：衰老因子（senescence factor, SF）、复制性衰老因子（replicative senescence factor, RsF）、静息因子（quiescence factor, QF）、诱导物特异性因子（inducer-specific factor, IsF）和衰老细胞清除应答因子（senolytic response factor, SrF）。SF区分广泛衰老条件与其他条件；RsF仅活化于LP，在DF中对应特定细胞群，在LF中未对应明确细胞群；QF对应雷帕霉素处理；IsF区分帕博西尼与博来霉素；SrF与navitoclax应答相关。SF在两种细胞中均富集一般形态特征；RsF在两细胞类型中富集特征不同——DF中富集趋化因子信号降低，LF中富集mRNA加工通路；SrF在LF中对应LF7细胞群并富集细胞周期进程通路。
