《Antioxidants》：Hesperetin Attenuates Experimentally Induced Skeletal Muscle Dysfunction by Modulating Time-of-Day-Dependent Gene Expression and Mitochondrial Redox-Related Markers
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骨骼肌衰老的特征在于肌原性分化受损、线粒体功能障碍、氧化应激及昼夜节律紊乱，这些因素共同促成肌少症和肌肉萎缩。橙皮素作为一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化和线粒体保护作用；然而，其在衰老过程中对骨骼肌昼夜节律调控的作用尚不明确。本研究采用D-半乳糖（D-gal，
骨骼肌衰老的特征在于肌原性分化受损、线粒体功能障碍、氧化应激及昼夜节律紊乱，这些因素共同促成肌少症和肌肉萎缩。橙皮素作为一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化和线粒体保护作用；然而，其在衰老过程中对骨骼肌昼夜节律调控的作用尚不明确。本研究采用D-半乳糖（D-gal，20 g/L）诱导的衰老C2C12肌管、D-gal（150 mg/kg体重，腹腔注射）诱导的衰老小鼠模型以及地塞米松（Dex，20 mg/kg体重，腹腔注射）诱导的肌肉萎缩模型，探究橙皮素（20 μM或100 mg/kg体重）的作用效应。在D-gal处理的小鼠中，橙皮素改善了悬挂试验表现并增加了琥珀酸脱氢酶（SDH）阳性面积，尤其在活动期更为显著。橙皮素还部分调节了核心时钟基因及线粒体功能相关基因的表达。在D-gal诱导的衰老C2C12肌管中，橙皮素改善了肌管形成，减少了衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性细胞、DCF-DA荧光和丙二醛（MDA）水平，增强了抗氧化酶活性，并改善了线粒体相关功能指标，包括三磷酸腺苷（ATP）水平、线粒体膜电位相关荧光、基于pMitoTimer的线粒体氧化相关信号以及Ppargc1a表达模式。这些发现表明，橙皮素可能通过调节时间依赖性基因表达、线粒体相关活性及肌肉相关功能标志物，对实验性诱导的骨骼肌功能障碍发挥保护作用。
**骨骼肌衰老与昼夜节律紊乱：研究背景与问题**
骨骼肌约占人体总质量的40%，是具有高度动态性和可塑性的组织。衰老伴随着骨骼肌质量与躯体机能的进行性下降，导致肌少症相关的功能障碍和骨骼肌功能衰退，进而增加跌倒、衰弱风险及发病率和死亡率。年龄相关的骨骼肌退化以功能减退和结构改变为特征，虽然功能损害与肌肉萎缩并非同一过程，但二者密切相关，共享多种分子机制，包括氧化应激、线粒体功能障碍、慢性炎症和蛋白稳态失衡。其中，线粒体氧化应激发挥核心作用，过量的活性氧（ROS）累积可损伤线粒体DNA和呼吸链组分，破坏氧化还原平衡，损害氧化磷酸化，进而削弱生物能稳态和蛋白质周转能力，最终激活蛋白水解途径，促进肌肉萎缩和功能衰退。
昼夜节律是周期为24小时的自持性生物振荡器，由核心时钟基因（如BMAL1、PERs、CRYs和RORs）构成的转录-翻译反馈环路驱动，调控躯体活动、摄食行为、激素分泌、睡眠-觉醒周期和代谢等生理过程。在骨骼肌中，昼夜节律调节线粒体能量产生、生物能学、抗氧化能力和肌原性分化等关键生理过程。活动期骨骼肌倾向于运动、底物利用和能量消耗，静息期则转向维持、修复和代谢恢复。随年龄增长，骨骼肌昼夜节律振幅降低、时相改变和稳定性下降，导致代谢调控紊乱。因此，恢复衰老骨骼肌的昼夜节律对于维持代谢稳态和肌肉功能至关重要。
黄酮类化合物是广泛存在于果蔬和药用植物中的天然多酚类物质，具有抗氧化、抗炎和代谢调节等生物活性，部分黄酮可通过调节核心时钟基因表达、改善线粒体功能和代谢稳态来缓解昼夜节律紊乱。橙皮素是来源于柑橘类的黄酮，已被广泛报道在氧化应激诱导的细胞和动物模型中发挥抗氧化作用，并在骨骼肌细胞模型和衰老小鼠中表现出线粒体保护效应。然而，橙皮素是否在衰老过程中调节骨骼肌昼夜节律和线粒体功能仍不清楚。基于此，本研究利用D-半乳糖诱导的衰老C2C12肌管模型和衰老小鼠模型，以及地塞米松诱导的分解代谢性肌肉萎缩模型，系统探究橙皮素对骨骼肌时间依赖性时钟调控和线粒体功能的影响。
**研究设计与主要技术方法**
研究人员采用多种实验模型与技术手段开展研究。动物实验采用6周龄雄性C57BL/6J小鼠，通过腹腔注射D-半乳糖（150 mg/kg体重）12周建立衰老模型，同时口服灌胃给予橙皮素（100 mg/kg体重）；地塞米松诱导的肌肉萎缩模型中，7周龄雄性C57BL/6J小鼠口服橙皮素（100 mg/kg体重），连续腹腔注射Dex（20 mg/kg/天）13天诱导肌肉萎缩。细胞实验使用C2C12小鼠成肌细胞系（ATCC #CRL-1772），以D-半乳糖（20 g/L）诱导细胞衰老，橙皮素浓度20 μM。主要技术方法包括：肌纤维染色与纤维类型定量分析（利用BA-D5、BF-F3和SC-71抗体区分MyHC I、IIA和IIB型纤维）、悬挂试验评估肌肉功能、琥珀酸脱氢酶（SDH）染色评估线粒体氧化能力、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测核心时钟基因和线粒体功能基因表达、MTT法检测细胞活力、H&E染色和免疫荧光染色评估肌管形态与肌球蛋白重链表达、SA-β-gal染色评估细胞衰老、DCF-DA荧光探针检测细胞内ROS、生化试剂盒检测MDA水平和SOD/CAT/GPx酶活性、pMitoTimer报告基因转染评估线粒体氧化状态、MitoTracker染色评估线粒体含量、ATP检测和JC-1染色评估线粒体膜电位（MMP）。
**研究结果**
**3.1 橙皮素改善D-半乳糖诱导衰老小鼠模型的肌肉性能**
各组小鼠体重无显著差异，肌纤维类型组成在各组间也无明显变化。对照组肌肉功能呈现昼夜节律性，活动期（ZT16）表现显著高于静息期（ZT4）。D-半乳糖处理降低了整体运动表现并削弱了肌肉功能的昼夜差异，ZT16时悬挂时间较对照组降低57.2%。橙皮素给药（100 mg/kg体重）使悬挂时间较D-半乳糖组提高100.5%，部分恢复了骨骼肌功能的昼夜节律模式，双因素方差分析显示显著的组别效应（p = 0.0009，偏η2 = 0.285），事后检验效能为0.973。
**3.2 橙皮素恢复D-半乳糖诱导衰老小鼠核心时钟基因振荡**
在ZT6和ZT18收集骨骼肌组织进行RT-qPCR分析。D-半乳糖处理显著破坏了Bmal1、Per2、Cry1、Nr1d1和Rorc等多个核心时钟基因的昼夜表达模式，部分基因呈现与对照组相反的相位。橙皮素治疗在ZT18时使Bmal1表达较D-半乳糖组显著增加74.9%，并在ZT6和ZT18分别使Per1表达升高414.2%和152.9%。这些结果表明橙皮素部分恢复并正常化了D-半乳糖诱导肌肉衰老过程中紊乱的核心时钟基因昼夜表达模式。
**3.3 橙皮素改善D-半乳糖诱导衰老小鼠线粒体相关指标**
对照组SDH阳性面积在ZT18较ZT6显著高93.6%，呈现明显的昼夜差异。D-半乳糖处理使ZT6和ZT18的SDH阳性面积分别减少51.0%和82.5%，并改变了正常的昼夜节律模式。双因素方差分析显示显著的组别效应（p < 0.0001，偏η2 = 0.728）和组别×时间交互作用（p = 0.0027，偏η2 = 0.482）。橙皮素治疗显著缓解了D-半乳糖诱导的SDH阳性面积减少，部分恢复了线粒体氧化能力的昼夜节律。在基因表达层面，D-半乳糖降低的Ucp2表达经橙皮素给药后在ZT6和ZT18分别显著增加288.9%和200.0%，Ucp3也呈现类似的振幅增大趋势。
**3.4 橙皮素对抗Dex诱导的骨骼肌萎缩**
Dex处理使小鼠体重下降1.11 ± 0.16 g，橙皮素治疗将体重变化改善至?0.11 ± 0.38 g。Dex组腓肠肌、跖肌和比目鱼肌的平均肌纤维横截面积（CSA）较对照组分别减少42.0%、37.0%和23.1%，橙皮素治疗分别使上述肌肉CSA增加15.0%、20.1%和17.9%。Dex处理使SDH阳性纤维比例在ZT18较对照组降低25.8%。在基因表达层面，Dex改变了Fbxo32和Trim63的ZT6–ZT18表达差异，橙皮素治疗使其恢复。Dex在ZT6使Pax7表达降低17.0%，橙皮素使其较Dex组增加57.3%；Dex使Myod1表达降低69.0%，橙皮素使其增加95.0%，并恢复了Myod1在对照组中观察到的ZT6–ZT18表达差异。
**3.5 橙皮素调节D-半乳糖诱导衰老分化C2C12细胞中紊乱的核心时钟基因振荡**
MTT实验确定20 μM为后续实验浓度。D-半乳糖处理显著降低细胞活力，而20 μM橙皮素在96小时使细胞活力较D-半乳糖组改善16.9%。在分化后第4天的C2C12细胞中，每4小时取样持续24小时分析核心时钟基因表达。D-半乳糖诱导的衰老显著削弱了核心时钟基因的振荡幅度，其中Per2呈现与对照组相反的振荡模式。橙皮素治疗使Per2的时相依赖性表达模式恢复正常水平，并显著提高了Bmal1、Per2和Rora的表达。
**3.6 橙皮素调节D-半乳糖诱导衰老中肌细胞分化和生肌基因的昼夜节律**
H&E染色和肌球蛋白重链（MHC）免疫荧光染色显示，D-半乳糖处理使MHC阳性面积减少约64%，橙皮素治疗使MHC阳性面积较D-半乳糖组增加约69%，改善了肌管形成和分化能力。在基因表达水平，D-半乳糖显著降低了Myf5、Myog和Myf6的整体表达水平和昼夜振幅，橙皮素部分恢复了Myf5表达，并显著增强了Myog和Myf6的昼夜振荡。
**3.7 橙皮素减轻D-半乳糖诱导细胞衰老中的氧化应激相关标志物**
SA-β-gal染色显示D-半乳糖组阳性细胞比例较对照组增加65.9%，橙皮素治疗使其较D-半乳糖组降低40.9%。D-半乳糖使DCF-DA荧光和MDA水平分别升高143.2%和149.3%，橙皮素分别使其降低44.1%和40.6%。D-半乳糖使GPx、SOD和CAT活性分别降低62.1%、48.6%和34.6%，橙皮素治疗分别使这些酶活性恢复85.7%、74.6%和32.3%。
**3.8 橙皮素改善D-半乳糖诱导衰老C2C12细胞的线粒体功能**
pMitoTimer成像显示D-半乳糖诱导的衰老成肌细胞中绿/红荧光比显著降低29.0%，表明线粒体氧化性衰老增加，橙皮素使该比值显著升高27.1%。MitoTracker荧光强度在D-半乳糖组较对照组降低21.0%，橙皮素使其增加19.3%。D-半乳糖使ATP水平降低约36.8%，橙皮素使其恢复41.1%。JC-1染色评估的MMP在D-半乳糖组降低46.2%，橙皮素使红/绿荧光比升高42.5%。Ppargc1a表达在D-半乳糖诱导的衰老肌管中呈现与对照组相反的相位模式，橙皮素治疗使其节律性表达模式正常化。
**讨论总结与结论**
研究人员指出，D-半乳糖模型主要反映衰老相关的功能和线粒体损伤，地塞米松模型代表糖皮质激素介导的分解代谢性肌肉萎缩，两种模型从不同但互补的角度涵盖了骨骼肌衰退的特征。研究选择ZT6和ZT18分别代表光照/静息期和黑暗/活动期的中点。橙皮素改善肌肉功能的效应在活动期更为明显，且不改变肌纤维类型组成，提示其作用可能主要与代谢和线粒体适应性相关而非纤维类型重塑。线粒体功能障碍和氧化应激是连接昼夜节律紊乱与骨骼肌衰老的核心机制，橙皮素恢复抗氧化酶活性、线粒体相关荧光、ATP水平和MMP相关荧光，并改善Ppargc1a这一受昼夜节律调控的线粒体生物合成关键调节因子的表达模式。研究同时承认了局限性：昼夜节律分析的时点有限、未直接检测上游信号通路和线粒体呼吸功能、仅纳入雄性小鼠等，未来需开展全周期节律分析、线粒体呼吸直接测量、剂量反应研究及药代动力学实验。
研究结论表明，橙皮素改善了实验性诱导的骨骼肌功能障碍的特定特征，伴随时间依赖性基因表达、氧化应激标志物和线粒体相关功能指标的变化。在D-半乳糖处理的肌管和小鼠中，橙皮素改善了肌原性分化标志物、氧化还原稳态和线粒体功能，以及悬挂试验表现。在Dex诱导的分解代谢性萎缩模型中，橙皮素也减轻了肌纤维尺寸的减少，在腓肠肌中效果明显。这些发现为深入研究橙皮素作为膳食生物活性化合物在衰老样和分解代谢应激条件下维持骨骼肌稳态提供了基础。
