《Cells》：Human Neuronal Modeling of DLG4-Related Synaptopathy Reveals Network Dysfunction and Partial Rescue by Omega-3 Fatty Acid Docosahexaenoic Acid (DHA)
编辑推荐：
DLG4相关突触病（SHINE syndrome）是一种罕见的神经发育障碍，由DLG4基因的致病变异引起，该基因编码突触后支架蛋白PSD-95，后者是兴奋性突触的核心组织者。然而，DLG4单倍剂量不足（haploinsufficiency）在人神经元中引起的细
DLG4相关突触病（SHINE syndrome）是一种罕见的神经发育障碍，由DLG4基因的致病变异引起，该基因编码突触后支架蛋白PSD-95，后者是兴奋性突触的核心组织者。然而，DLG4单倍剂量不足（haploinsufficiency）在人神经元中引起的细胞及网络水平后果仍未被完全阐明，且缺乏针对该疾病的靶向治疗策略。本研究中，研究人员使用来自一位SHINE综合征患者的人源诱导神经元（induced neurons），探究PSD-95缺陷对突触蛋白表达、神经元形态和神经网络活动的影响。SHINE神经元表现出PSD-95水平降低、神经突形态受损、放电频率（firing rate）及簇发频率（burst frequency）降低、簇发时程（burst duration）延长以及网络同步性（network synchrony）下降。ω-3多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）处理后，PSD-95蛋白水平显著升高，并改善了多项神经网络活动参数。DHA暴露还与细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）和cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein, CREB）磷酸化增加的趋势相关。综上，这些发现表明患者来源的SHINE神经元表现出突触后组织、神经元形态及网络功能的改变，并提供证据表明DHA可部分恢复该疾病的突触及网络功能。
**一、研究背景与科学问题**
兴奋性突触的突触后致密区（postsynaptic density, PSD）是组织神经递质受体、支架蛋白及信号分子的复杂结构，其中由DLG4基因编码的突触后致密蛋白-95（PSD-95）作为核心支架蛋白，通过连接N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体与胞内信号通路及细胞骨架元件，参与突触成熟、受体聚集和活动依赖的突触可塑性。DLG4单等位基因失功能变异导致罕见的神经发育障碍——DLG4相关突触病（SHINE综合征），临床表现为发育迟缓、智力障碍、癫痫、肌张力低下及孤独症谱系障碍（ASD）。然而，人神经元中DLG4单倍剂量不足在细胞及网络水平的功能后果尚不完全清楚，且缺乏靶向治疗策略。基于此，研究人员利用SHINE综合征患者来源的人诱导多能干细胞（iPSC）分化神经元，系统探究PSD-95缺失对突触蛋白表达、神经元形态及神经网络活动的影响，并评估二十二碳六烯酸（DHA）的潜在修复作用。
**二、研究方法概要**
研究人员使用一例携带DLG4 c.455delG（p.G152Afs*12）移码变异的SHINE患者来源iPSC系（CH1371）及一例无关野生型（WT）对照iPSC系（GM0323），经双SMAD抑制神经诱导和前脑神经元分化获得诱导神经元（iN）。主要技术包括：蛋白质印迹（Western blot）检测PSD-95蛋白水平及ERK/CREB磷酸化；高内涵免疫荧光成像（Opera Phenix系统）分析PSD-95荧光强度、突触小体密度、MAP2信号及神经突总长度；微电极阵列（MEA）记录自发网络活动，计算平均放电频率、网络簇发频率、簇发时程及同步性指数。DHA（50 μM）处理24小时用于蛋白及网络分析，处理30分钟用于信号通路磷酸化检测。免疫荧光和Western blot实验各含三次独立生物学重复，MEA为单一纵向实验含每条件5个重复孔。
**三、主要研究结果**
**（1）SHINE神经元PSD-95表达降低并伴神经突形态异常**：蛋白质印迹显示SHINE iN中PSD-95蛋白水平约为WT的40%，β-Tubulin III无显著差异；免疫荧光显示PSD-95强度降低约34%，MAP2信号降低约40%，PSD-95突触小体密度降低约30%但未达统计学显著，总神经突长度减少约50%。表明DLG4单倍剂量不足不仅导致突触后支架蛋白缺失，还伴随神经元结构发育异常。
**（2）SHINE神经元表现出神经网络活动受损**：MEA记录显示，SHINE iN的平均放电频率较WT下降约8倍，网络簇发频率下降约6.6倍，网络簇发时程延长约2.2倍，同步性指数下降约5.5倍。表明PSD-95减少导致网络水平的兴奋性组织缺陷，表现为放电减弱、簇发效率降低及网络协调性下降。
**（3）DHA增加PSD-95表达并改善神经网络活动**：DHA处理使SHINE iN中PSD-95蛋白水平几乎翻倍；平均放电频率升高约1.8倍，网络簇发时程缩短约28%，网络同步性升高约1.8倍。同一培养孔DIV44至DIV45纵向分析显示时间×处理交互效应显著，而载体处理组保持稳定。WT神经元中DHA也显著增加PSD-95荧光强度和突触小体密度，但网络参数变化不显著，提示DHA的分子效应不限于SHINE神经元，而网络水平响应存在基因型差异。
**（4）DHA与ERK和CREB磷酸化增加趋势相关**：DHA处理30分钟后，pERK/tERK比值升高约1.7倍，pCREB/tCREB比值升高约2.4倍，但均未达统计学显著，提示ERK/CREB通路可能参与DHA效应但尚不能确证为机制中介。
**四、讨论与结论**
SHINE iN再现了DLG4单倍剂量不足的核心分子、结构与功能表型：PSD-95减少伴随MAP2信号降低和神经突缩短，提示突触支架破坏可能影响神经元结构成熟；网络层面的放电、簇发及同步性缺陷符合PSD-95在AMPA受体稳定和兴奋性突触成熟中的核心作用，与SHANK3相关疾病及脆性X综合征（FXS）人源模型的网络同步缺陷类似。DHA可部分恢复PSD-95丰度并改善放电、簇发动力学及网络同步性，但未能完全恢复WT状态。研究局限性包括单条患者系与单条无关对照系遗传背景差异、单一分化批次MEA实验、体外模型主要聚焦兴奋性神经元，未来需在更多患者系或等基因模型、类器官或体内系统及包含抑制性中间神经元和胶质细胞的共培养体系中进一步验证。
**结论**：SHINE iN是一种疾病相关的人源神经元模型，研究人员在其中明确了分子、结构和功能异常表型，且这些疾病相关异常是可修饰的。DHA增加了SHINE iN中PSD-95丰度并改善了神经网络活动，表明在SHINE综合征人源模型中PSD-95水平和网络组织可向有利方向转变。这些发现将DHA确定为候选突触修饰剂，支持进一步评估基于脂质的治疗策略用于SHINE综合征。
