造血细胞特异性DARC缺失加剧饮食诱导肥胖小鼠的脂肪组织炎症与葡萄糖耐受不良

《Cells》：Hematopoietic-Specific DARC Deficiency Is Associated with Adipose Tissue Inflammation and Impaired Glucose Tolerance During Diet-Induced Obesity in Mice

　　

目的：肥胖状态下的脂肪组织炎症促进胰岛素抵抗（insulin resistance）和代谢性疾病的发生。达菲抗原趋化因子受体（Duffy Antigen Receptor for Chemokines, DARC）是一种表达于红细胞及其他细胞类型的非信号传导受体，通过调节趋化因子水平来调控炎症反应。影响红细胞DARC表达的基因变异在非洲裔人群中较为常见。本研究通过分别破坏造血细胞和脂肪细胞中的DARC表达，探讨其对肥胖的影响。方法：将DARC-floxed小鼠分别与Vav1-Cre小鼠杂交以破坏造血细胞中的DARC表达（DARC^Δhemato），以及与Adipoq-Cre小鼠杂交以破坏脂肪细胞中的DARC表达（DARC^Δadipo）。小鼠分别接受普通饲料（chow diet, CD）或高脂饲料（high-fat diet, HFD）喂养并进行体内研究。体外研究采用从野生型（wild-type, WT）和全身性DARC敲除小鼠中分离的前脂肪细胞。结果：与WT同窝对照相比，HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠表现出葡萄糖耐量受损，且独立于体重增加。该变化伴随脂肪组织炎症加重和全身性氧化应激（oxidative stress）水平升高。DARC^Δadipo小鼠的葡萄糖耐量与WT相似，但脂肪组织重量和脂肪细胞大小存在细微差异。前脂肪细胞中DARC的缺失对体外成脂分化和脂质积累无显著影响。同样，内皮细胞特异性DARC敲除（DARC^ΔEC）小鼠的葡萄糖耐量与WT相比亦无差异。结论：造血细胞中DARC的破坏与饮食诱导肥胖期间的脂肪组织炎症相关，并改变葡萄糖稳态，同时伴有循环中多种DARC结合趋化因子水平的降低。这些发现与人类DARC基因变异及肥胖相关代谢性疾病的相关性值得进一步研究。

**论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

肥胖是一种以慢性低度脂肪组织炎症为特征的病理状态，伴随促炎性细胞因子和趋化因子（chemokines）产生的增加。其中，肿瘤坏死因子α（TNFα）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1，又称CCL2）等已被证实与胰岛素抵抗的发生存在因果关系，而胰岛素抵抗是肥胖相关代谢性疾病和2型糖尿病（type 2 diabetes）的核心特征之一。

趋化因子除与其特异性信号传导受体结合外，还可与多种非信号传导受体相互作用，其中最引人注目的是非典型趋化因子受体1（atypical chemokine receptor 1, ACKR1），亦称为达菲抗原趋化因子受体（Duffy Antigen Receptor for Chemokines, DARC）。在人类中，DARC主要表达于红细胞以及毛细血管和后毛细血管内皮细胞，被认为通过在炎症部位螯合趋化因子和/或调节其局部浓度来发挥功能。DARC具有广泛的配体结合能力，可与多种C-C基序和C-X-C基序趋化因子结合，且对CCL2/MCP-1具有特别强的结合亲和力。

人类DARC基因主要存在三种等位基因：FYB、FYA和FYO，其分布频率因地区和祖先来源而异。FYO等位基因与红细胞上DARC表达的选择性缺失相关，被认为源自间日疟原虫（Plasmodium vivax）施加的选择压力。值得注意的是，非洲裔美国人表现出更强的炎症反应，且肥胖相关代谢性疾病风险高于高加索人种，非肥胖的非洲裔美国人胰岛素敏感性亦较低，提示DARC基因型等祖先因素可能参与其中。

研究人员此前已报道，全身性DARC敲除（DARC KO）小鼠在接受高脂饲料喂养后表现出加重的脂肪组织炎症和胰岛素抵抗，且非肥胖的DARC KO小鼠在普通饲料喂养条件下也出现葡萄糖耐量受损。这提示DARC可能通过不依赖于趋化因子浓度上调的机制调节胰岛素诱导的葡萄糖摄取。鉴于DARC在造血细胞、脂肪细胞和内皮细胞等多种细胞类型中均有表达，一个重要的问题是：DARC是否通过特定的细胞区室来调节肥胖相关的葡萄糖耐受不良？

**二、研究目的与总体设计**

为回答上述问题，研究人员构建了DARC-floxed小鼠模型，旨在确定造血细胞中DARC表达的破坏是否会加剧肥胖相关的代谢性疾病。同时，研究人员检测了胰岛素敏感组织中DARC的表达，意外发现脂肪组织中DARC呈高水平表达，因此进一步研究了成熟脂肪细胞中DARC在饮食诱导肥胖中的作用。此外，还构建了内皮细胞特异性DARC敲除小鼠以评估内皮细胞来源DARC的贡献。

**三、主要关键技术方法**

研究采用的关键技术方法包括：通过将DARC-floxed小鼠分别与Vav1-Cre、Adiponectin-Cre和VE-Cadherin-Cre小鼠杂交，构建造血细胞特异性（DARC^Δhemato）、脂肪细胞特异性（DARC^Δadipo）和内皮细胞特异性（DARC^ΔEC）DARC敲除小鼠模型。采用高脂饲料（60%脂肪供能）喂养方案建立饮食诱导肥胖模型，最长持续40周。通过核磁共振波谱（NMR spectroscopy）测量身体组成，进行葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）评估糖代谢。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中MCP-1、IL-6、TNFα、胰岛素及氧化应激标志物8-异前列腺素（8-isoprostane）和4-羟基-2-壬烯醛（HNE）的水平。通过定量PCR（qRT-PCR）检测组织基因表达，Western blot检测蛋白表达。采用Luminex多因子检测平台进行血浆促炎性细胞因子谱分析，流式细胞术（flow cytometry）评估外周血免疫细胞亚群频率。此外，从WT和全身性DARC KO小鼠中分离前脂肪细胞（preadipocytes），进行体外成脂分化和胰岛素刺激的葡萄糖摄取检测。

**四、主要研究结果**

**4.1 造血细胞特异性DARC破坏改变葡萄糖耐量但不影响体重增加**

DARC^Δhemato小鼠与WT小鼠在HFD喂养后体重增加相当，身体组成亦无显著性差异。然而，HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠表现出葡萄糖耐量受损，GTT曲线下面积（AUC）显著增大，但ITT的血糖消失速率常数（KITT）在基因型间差异不显著。血浆胰岛素水平在两组间无差异，胰腺β细胞丰度亦相当，提示造血细胞DARC缺失相关的葡萄糖耐量受损并非由胰岛素分泌障碍所致。值得注意的是，DARC^Δhemato小鼠出现更明显的肝脏增大和肝脂肪变性（hepatic steatosis），且循环白细胞（包括单核细胞和中性粒细胞）有升高趋势，血浆中DARC结合趋化因子（包括CCL2、CCL5、CCL11和CXCL1）水平则显著降低。

**4.2 HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠脂肪组织炎症加重**

与WT小鼠相比，HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠内脏脂肪组织（visceral fat）中MCP-1蛋白水平升高，Mcp-1、Il-6、Tnfα及CCL5、CXCL1等趋化因子mRNA表达上调。F4/80免疫染色显示，HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠内脏脂肪中巨噬细胞浸润增加，冠状结构（crown-like structures）数量显著增多。促炎性M1型巨噬细胞标志基因Nox2和Ptgs2表达升高，抗炎性M2型标志基因Arg1和Retnla表达降低。同时，DARC^Δhemato小鼠血浆中氧化应激标志物8-异前列腺素和HNE水平显著升高，表明全身性氧化应激加重。

**4.3 DARC缺失不影响体外成脂分化和葡萄糖摄取**

DARC mRNA在骨髓和脾脏中高表达，同时在皮下和内脏脂肪组织中也检测到显著表达。在普通饲料条件下，全身性DARC KO小鼠的皮下脂肪细胞显著增大，HFD条件下则表现为内脏脂肪细胞增大。然而，体外实验表明，从DARC KO小鼠分离的前脂肪细胞在成脂分化能力、脂质积累（Oil Red O染色）以及PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、FABP4（脂肪酸结合蛋白4）、脂联素（adiponectin）和C/EBPα（CCAAT/增强子结合蛋白α）等成脂标志物的表达方面，与WT细胞无差异。胰岛素刺激的葡萄糖摄取和AKT磷酸化水平在两组间亦无显著性差异。

**4.4 脂肪细胞特异性DARC缺失与HFD条件下的葡萄糖耐量无关**

DARC^Δadipo小鼠在CD喂养条件下表现出皮下脂肪细胞增大和体脂比例升高，但HFD喂养后体重增加、脂肪组织重量和葡萄糖耐量均与WT小鼠相似，ITT结果亦无差异。肝脏重量在两组间也无显著差别。

**4.5 内皮细胞特异性DARC缺失不影响体重和葡萄糖耐量**

DARC^ΔEC小鼠在HFD喂养后的体重和葡萄糖耐量与WT对照相比均无显著差异。

**五、讨论与结论**

本研究利用新型DARC-floxed小鼠模型，证实造血细胞特异性DARC的破坏可加重饮食诱导肥胖期间的脂肪组织炎症，从而促进葡萄糖耐受不良。这一发现提示，影响红细胞DARC表达的基因变异（在非洲裔人群中常见）可能损害机体控制脂肪组织炎症的能力，从而增加肥胖相关代谢性疾病和2型糖尿病的易感性。

在机制层面，造血细胞特异性DARC缺失导致循环中DARC结合趋化因子水平降低，同时脂肪组织内炎性趋化因子积累，这与DARC在调节肥胖状态下趋化因子分布中的作用相符。然而，本研究未能证实红细胞趋化因子缓冲或转运功能受损是导致脂肪组织炎症加重和代谢异常的直接原因。此外，HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠虽然脂肪组织炎症加重，但脂肪细胞数量和大小与WT无差异，其机制尚不清楚。

关于脂肪细胞DARC功能的研究表明，DARC在脂肪细胞中的表达可能调节体内脂肪细胞形态的某些方面，但DARC^Δadipo小鼠在HFD条件下未表现出显著的代谢异常。体外实验则显示DARC缺失不影响成脂分化和胰岛素刺激的葡萄糖摄取。这些体内外研究结果的差异可能源于体外脂肪细胞模型无法完全模拟整体组织和动物水平的脂肪组织发育与生长过程。内皮细胞特异性DARC缺失的结果进一步提示，脂肪组织中非脂肪细胞群体的DARC在脂肪组织炎症和代谢功能障碍中的作用可能较为有限。

研究存在的局限性包括：Vav1-Cre驱动的缺失涵盖全部造血细胞，而非仅红细胞，限制了与人类FYO基因型（仅红细胞DARC缺失）的可比性；GTT和ITT在造血细胞和脂肪细胞特异性模型中进行的时间点不同，限制了直接比较；机制分析部分样本量较小；未对雌性小鼠进行研究（但研究人员此前研究显示雌性全身性DARC KO小鼠亦存在葡萄糖耐量降低）。

研究结论：造血细胞中DARC的破坏与肥胖期间循环趋化因子水平改变、脂肪组织炎症和氧化应激加重以及葡萄糖稳态受损相关。鉴于本研究所用造血细胞特异性小鼠模型与人类基因变异相关的红细胞选择性DARC缺失之间存在差异，这些发现与人类DARC变异和代谢性疾病的相关性有待进一步研究。