《Foods》：α- and β-Casein Differentially Protect Anthocyanins from Three Red Grape (Vitis vinifera L.) Cultivars During Simulated Gastrointestinal Digestion
编辑推荐：
葡萄因其高花色苷（anthocyanins）含量而备受重视，但这些化合物的生物功效因其较低的消化回收率（digestive recovery）而受到限制。本研究评估了牛乳酪蛋白（caseins）是否能提高三个红葡萄（Vitis vinifera L.）品种花
葡萄因其高花色苷（anthocyanins）含量而备受重视，但这些化合物的生物功效因其较低的消化回收率（digestive recovery）而受到限制。本研究评估了牛乳酪蛋白（caseins）是否能提高三个红葡萄（Vitis vinifera L.）品种花色苷的消化回收率。通过高效液相色谱-二极管阵列检测-电喷雾离子化质谱（HPLC-DAD-ESI-MS）对花色苷进行谱图分析，采用分光光度法测定总酚含量（total phenolic content）、总黄酮含量（total flavonoid content）及抗氧化能力（antioxidant capacity），在B16-F10小鼠黑色素瘤细胞（murine melanoma cells）上评估对细胞活力（cell viability）的影响，并根据标准化静态体外消化方案（INFOGEST protocol），在有或无α-酪蛋白（α-casein）或β-酪蛋白（β-casein）的条件下测定花色苷的消化回收率。共检测到13种花色苷，其中锦葵色素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside）在所有品种中占主导地位。Feteasc? Neagr?品种显示出最高的总酚含量（535.01 ± 38.43 mg没食子酸当量（gallic acid equivalents, GAE）/100 g鲜重（fresh weight, FW））、总黄酮含量（202.52 ± 30.61 mg儿茶素当量（catechin equivalents, CE）/100 g）和抗氧化活性，其提取物以浓度依赖性方式降低黑色素瘤细胞活力，在测试浓度范围内细胞活力保持在50%以上。消化过程中总花色苷回收率从胃相后的43.29–46.22%下降至肠相后的8.82–12.25%。α-酪蛋白在所有品种中将上述数值分别显著提高至53.48–55.84%和15.58–24.74%。β-酪蛋白在胃相中无显著影响，仅在肠相中对黑比诺（Pinot Noir）品种有效（从10.51%提高至19.10%）。因此，α-酪蛋白限制了葡萄花色苷的肠道降解，而品种组成决定了该效应的程度。
**论文解读**
**研究背景与存在问题**
葡萄富含花色苷（anthocyanins），这是一类与降低多种慢性病风险相关的酚类化合物（phenolic compounds），尤其在结肠癌、黑色素瘤等模型中显示出抗增殖（antiproliferative）和促凋亡（proapoptotic）效应。然而，花色苷的生物功效（biological efficacy）受到消化回收率（digestive recovery）低的严重制约。花色苷在胃部酸性环境（pH值较低）下以稳定的黄烊盐阳离子（flavylium cation）形式存在，相对稳定；但当其进入小肠后，随着pH值升高至近中性，花色苷迅速发生水合反应（hydration）和开环降解，加上溶解氧、消化酶和胆汁盐（bile salts）的协同降解作用，仅有极少部分能以可吸收形式抵达肠上皮。以往研究报道葡萄花色苷的消化回收率在胃相后约为45%，肠相后仅有7.6%左右，远低于10%，这成为限制其体内发挥健康效应的关键瓶颈。
已有研究表明，牛乳酪蛋白（caseins），尤其是α-酪蛋白和β-酪蛋白，可通过疏水相互作用（hydrophobic interactions）和氢键（hydrogen bonding）与花色苷形成蛋白-多酚复合物（protein-polyphenol complexes），从而限制花色苷降解并促进其在胃肠道中的缓释。然而，此前关于花色苷-酪蛋白相互作用的研究多采用蓝莓提取物或未明确品种的葡萄皮材料，无法将保护效应与特定的品种花色苷谱图（anthocyanin profile）关联起来；同时，已有葡萄研究来自不同季节和种植条件，环境变量的混杂使得品种间比较难以进行。此外，Feteasc? Neagr?作为罗马尼亚本土品种，此前尚无任何消化回收数据；而对B16-F10黑色素瘤细胞系的抗增殖活性研究也主要局限于葡萄果渣提取物（grape pomace extracts），缺乏对葡萄皮花色苷富集提取物的系统评估。因此，在控制品种、环境和实验方案的条件下，同时考察品种特异性花色苷组成、单一酪蛋白组分（α和β）的差异化效应、模拟消化回收率以及细胞活力影响，成为亟待填补的研究空白。
**研究内容与重要意义**
研究人员提出假设：α-酪蛋白和β-酪蛋白因疏水性和电荷分布的差异，与葡萄花色苷的结合程度不同，因此在模拟消化中对花色苷降解的限制作用不等，且该差异在肠相最为显著，并受到品种花色苷谱图的调控。为验证这一假设，研究人员选取三个红葡萄（Vitis vinifera L.）品种——罗马尼亚本土品种Feteasc? Neagr?以及国际参照品种梅洛（Merlot）和黑比诺（Pinot Noir），三者均种植于同一葡萄园（特兰西瓦尼亚地区）、同一年份（2024年秋季）采收，以最大限度排除环境和栽培因素的干扰。首先对提取物的理化性质、总多酚、总黄酮和花色苷含量及抗氧化活性进行系统表征，然后采用INFOGEST标准化静态体外消化方案（standardized static in vitro digestion）评估在有/无α-酪蛋白或β-酪蛋白条件下花色苷的消化回收率，并选取花色苷含量最高的Feteasc? Neagr?品种的未消化提取物，测试其对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞（murine melanoma cells）活力的影响。该研究的独特价值在于：首次在同一套样品上同时完成品种特异性花色苷谱图鉴定、单一酪蛋白组分与花色苷的相互作用、模拟消化回收率的定量评估以及细胞活力的初步筛查，从而将每种酪蛋白组分的保护效应直接归因于已知的花色苷组成，而非跨研究推断。研究结果为开发以花色苷-酪蛋白复合体系为基础的功能性食品（functional food）提供了理论依据，也为理解膳食蛋白-多酚相互作用的品种依赖性提供了新的实验证据。
**关键技术方法概述**
研究材料为种植于罗马尼亚特兰西瓦尼亚地区同一实验葡萄园、于2024年秋季同一采收季获得的三个红葡萄品种（Feteasc? Neagr?、Merlot、Pinot Noir），每个品种设三个独立生物重复。主要技术方法包括：采用酸化甲醇（acidified methanol，含0.3% HCl）提取葡萄皮花色苷，经Amberlite XAD-7和Sephadex LH-20柱层析纯化后，通过HPLC-DAD-ESI-MS进行花色苷鉴定与定量；以Folin-Ciocalteu法测定总酚含量（TPC），以铝盐比色法（AlCl
3法）测定总黄酮含量（TFC）；采用DPPH、ABTS、ORAC和FRAP四种互补性抗氧化活性测定方法；使用WST-1比色法评估花色苷富集提取物对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞的活力影响；采用INFOGEST标准化静态体外消化方案，在37 °C下依次进行口腔相（2 min）、胃相（2 h）和肠相（2 h）模拟消化，以酪蛋白与提取物质量比约1:1（终浓度0.1 mg/mL）加入α-或β-酪蛋白；采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Duncan多重极差检验及主成分分析（PCA）进行数据处理。
**主要研究结果**
**（1）理化参数与植物化学成分**：三个品种的pH值（3.30–3.60）和可滴定酸度（4.30–6.20 g/L）无显著差异，处于温带葡萄种植区酿酒葡萄技术成熟期的典型范围。Feteasc? Neagr?品种的总酚含量（535.01 ± 38.43 mg GAE/100 g FW）、总黄酮含量（202.52 ± 30.61 mg CE/100 g FW）和总花色苷含量（total anthocyanin content, TAC）均显著高于另外两个品种（p < 0.05），而Pinot Noir各项指标均为最低。
**（2）抗氧化活性**：Feteasc? Neagr?在DPPH、ABTS和FRAP测定中显示出最强的抗氧化活性（antioxidant activity），其中ABTS和FRAP值显著高于Merlot和Pinot Noir；ORAC测定中三个品种无显著差异，但Merlot数值最高。采用加权抗氧化指数（weighted antioxidant index）综合评估后确认Feteasc? Neagr?具有最高的整体抗氧化能力。
**（3）花色苷鉴定与定量**：通过HPLC-DAD-ESI-MS共鉴定出13种花色苷，Feteasc? Neagr?检出全部13种，Merlot检出12种，Pinot Noir仅检出8种。锦葵色素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside, M3G）在所有品种中含量最高，其次为芍药色素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside）。品种间花色苷组成差异显著：Feteasc? Neagr?的酰基化花色苷（acylated anthocyanins）占比最高（19.5%），主要由对香豆酰基化衍生物（p-coumaroylated derivatives）贡献（16.7%）；Pinot Noir酰基化比例最低（7.6%），且未检出锦葵色素-3-O-对香豆酰葡萄糖苷（malvidin-3-O-p-coumaroylglucoside）。Pinot Noir的芍药色素-3-O-葡萄糖苷比例显著偏高，呈现独特的单葡萄糖苷（monoglucoside）主导型谱图。
**（4）对B16-F10黑色素瘤细胞活力的影响**：采用Feteasc? Neagr?的花色苷富集提取物（0–10 μg M3G当量/mL）处理B16-F10细胞24小时后，细胞活力呈浓度依赖性下降。0.4 μg/mL浓度下无显著效应，自0.6 μg/mL起细胞活力显著降低，最大降幅约30%，但在整个测试浓度范围内细胞活力始终保持在50%以上。
**（5）模拟消化中的花色苷回收率**：在不添加酪蛋白的对照条件下，总花色苷消化回收率从胃相后的43.29–46.22%骤降至肠相后的8.82–12.25%，与文献报道趋势一致。胃相中回收率最高的单体花色苷为芍药色素-3-O-葡萄糖苷（各品种均超过58%），最低的为对香豆酰基化衍生物；肠相中则转为酰基化花色苷回收率最高（如Feteasc? Neagr?中的飞燕草素-3-O-对香豆酰葡萄糖苷（delphinidin-3-O-p-coumaroylglucoside）、Merlot中的矮牵牛素-3-O-乙酰葡萄糖苷（petunidin-3-O-acetylglucoside）），而飞燕草素-3-O-葡萄糖苷（delphinidin-3-O-glucoside）在三个品种的肠相回收率均为最低。
**（6）α-酪蛋白和β-酪蛋白对花色苷回收率的影响**：α-酪蛋白在所有三个品种、两个消化相中均显著提高了总花色苷回收率：胃相提高9.1–11.2个百分点，肠相提高6.8–12.5个百分点（相当于较对照组增加77–102%）。β-酪蛋白在胃相中对所有品种均无显著影响；在肠相中仅对Pinot Noir产生显著提升效果（从10.51%提高至19.10%），对Feteasc? Neagr?和Merlot无效。就单体花色苷而言，α-酪蛋白的保护效应主要作用于非酰基化的3-O-单葡萄糖苷类（non-acylated 3-O-monoglucosides）。Merlot中的矮牵牛素-3-O-对香豆酰葡萄糖苷（petunidin-3-O-p-coumaroylglucoside）是唯一一种β-酪蛋白优于α-酪蛋白的化合物。
**（7）主成分分析（PCA）**：前两个主成分（F1和F2）共解释总方差的92.22%。F1（57.72%）主要按总酚含量和总花色苷含量将品种分离；TAC、TPC、M3G、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷（petunidin-3-O-glucoside, Pet3G）和TFC之间呈强正相关，DPPH、FRAP和ABTS三种抗氧化测定间亦呈紧密正相关。
**（8）品种与酪蛋白处理的主效应分析**：双因素方差分析表明，在胃相中品种对矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside）和Pet3G的回收率有显著主效应，酪蛋白处理对除矢车菊素-3-O-葡萄糖苷以外的主要花色苷均有显著影响，且无显著的品种×处理交互作用。在肠相中，品种和酪蛋白处理对所有主要花色苷均有显著主效应，仅在飞燕草素-3-O-葡萄糖苷的回收率上检测到显著的品种×处理交互作用。
**讨论总结与研究结论**
讨论部分指出，花色苷在胃相的高回收率与肠相的急剧下降反映了pH依赖性结构转化（黄烊盐阳离子→甲醇假碱（carbinol pseudobase）→查尔酮（chalcone））的核心作用。α-酪蛋白在两相中的显著保护效应，与文献报道的α-酪蛋白对锦葵色素-3-O-葡萄糖苷结合亲和力更高、且较β-酪蛋白更耐受酶促水解的结论一致。β-酪蛋白作为胃蛋白酶（pepsin）的优先底物，其C端疏水结构域在胃消化早期即被裂解，这可能是β-酪蛋白效应有限且仅对Pinot Noir有效的分子基础。品种方面，Feteasc? Neagr?较高的酰基化比例（19.5%）通过分子内辅色作用（intramolecular copigmentation）赋予花色苷更强的近中性pH稳定性，与其肠相回收率最高相一致；Pinot Noir以单葡萄糖苷为主（92.4%），酰基化程度最低，花色苷更易遭受pH驱动降解，这同时也减少了竞争性结合位点，可部分解释β-酪蛋白仅在该品种中显著有效。研究人员同时审慎指出若干局限性：消化底物为酸化甲醇提取物而非完整葡萄皮，回收率值为上限估计；仅测试了单一酪蛋白浓度；未监测酪蛋白水解程度；消化模型缺乏肠道微生物群和细胞吸收模型；细胞实验采用未消化提取物，尚不能与消化回收率数值直接衔接。
研究结论为：α-酪蛋白在模拟胃肠消化中对三个红葡萄品种的花色苷均具有显著保护作用，β-酪蛋白效应有限且具有品种依赖性，支持了最初的假设（对α-酪蛋白完全支持，对β-酪蛋白仅部分支持）。Feteasc? Neagr?品种的多酚、黄酮含量和抗氧化活性均最高，其提取物以浓度依赖性方式降低B16-F10小鼠黑色素瘤细胞活力。研究结果表明，葡萄花色苷的消化行为取决于品种特异性组成和与膳食蛋白的相互作用，花色苷-酪蛋白复合体系值得在功能性食品应用领域开展进一步研究，但需通过完整葡萄基质的消化实验、复合物的直接表征以及最终的体内研究予以验证。
