FTIR–ATR光谱联用化学计量学建模实现蜂蜜中主要糖基掺假物的检测、鉴别与定量分析

《Foods》：Detection, Differentiation and Quantification of Major Sugar Based Adulterants in Honey Using FTIR–ATR Spectroscopy Coupled with Chemometric Modeling

　　

蜂蜜因其较高的商业价值和日益增长的消费需求，成为最常被掺假的食品之一。使用廉价糖浆掺假是影响蜂蜜真实性的重大挑战，并导致消费者对蜂蜜供应链的信心下降。本研究评估了傅里叶变换红外光谱联用衰减全反射技术（FTIR–ATR，Fourier Transform Infrared Spectroscopy coupled with Attenuated Total Reflectance）与化学计量学建模检测、分类和定量蜂蜜样品中主要糖基掺假物（即果糖、葡萄糖、转化糖、粗糖糖浆、麦芽糖和蔗糖）的能力。研究中，将多花蜂蜜样品分别用每种掺假物按1%、5%、10%和20%（w/w）的比例进行实验性掺假，在650–4000 cm^?1范围内采集FTIR光谱，并使用碳水化合物指纹区（1500–750 cm^?1）进行多变量分析。结果表明，主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）可区分纯蜂蜜与掺假蜂蜜样品，并呈现浓度依赖性的聚类模式，而偏最小二乘回归（PLSR，Partial Least Squares Regression）表现出优异的预测性能。校正决定系数R²值范围为0.9656至1.0000，而重复水平的保留评估给出的R²值为0.9270–0.9999，预测标准误差（SEP，Standard Error of Prediction）为0.1342%–2.0250%。偏最小二乘判别分析（PLS-DA，Partial Least Squares Discriminant Analysis）在校正集和保留数据集中分别给出了92.0%和88.0%的总体样品水平分类准确率，宏平均类别准确率分别为97.71%和96.57%。这些发现表明，FTIR–ATR光谱联用化学计量学建模作为一种快速、无损、可靠且经济高效的蜂蜜常规真实性检测替代方法具有巨大潜力，可成为质量控制实验室、监管机构和蜂蜜行业的宝贵工具。

**论文解读**

**研究背景与问题**

蜂蜜是由蜜蜂采集植物花蜜或分泌物并经酶转化、脱水、成熟而形成的天然甜味物质，含有约200种不同的有机和无机成分，其中葡萄糖和果糖等单糖约占80%。因其抗菌、抗炎、抗衰老及免疫调节等功效，蜂蜜自古以来便被广泛用作天然疗愈食品。然而，较高的商业价值与不断增长的消费需求使蜂蜜成为全球最常被掺假的食品之一——在欧洲位列十大最常掺假食品，在美国是仅次于牛奶和橄榄油的第三大欺诈对象。蜂蜜掺假的主要形式包括直接添加糖浆、间接通过蜜蜂过度喂糖以及高低品质蜂蜜混合。常用的掺假物包括葡萄糖浆、蔗糖浆、高果糖玉米糖浆、甜菜糖浆和转化糖浆等；在巴基斯坦和印度，粗糖（jaggery）和蔗糖是常见的掺假物。

巴基斯坦位列全球蜂蜜生产国第20位，年出口约4000吨至阿拉伯国家，出口额约2300万美元，国内年消费量约11000吨。然而，巴基斯坦蜂蜜行业面临监管薄弱和质量控制体系不健全的严峻挑战。2017年旁遮普省食品管理局查获约30吨掺有工业染料的蜂蜜；2022年巴基斯坦食品安全与清真食品管理局查获4000升掺糖、化学物质和蜂蜡的假冒蜂蜜。Kausar等人报道，旁遮普省40%的原料蜂蜜样品因羟甲基糠醛（HMF，Hydroxymethylfurfural）水平升高、糖组成异常和水分超标而不符合旁遮普省纯食品法规。传统的蜂蜜掺假检测方法如薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和稳定碳同位素比值分析（SCIRA）等，虽各具优势，但普遍存在耗时长、样品破坏性大、依赖昂贵试剂和仪器的局限。因此，开发快速、经济、操作简便的替代检测技术势在必行。FTIR–ATR作为一种振动光谱技术，通过识别分子独特的振动特征实现快速、无损、无需复杂样品前处理的分析，与化学计量学方法结合后可有效提取复杂数据中的有用模式。已有研究表明该联用策略在蜂蜜糖类成分分析、植物源和地理源判别及掺假检测方面展示出良好潜力，但多数研究仅涉及有限种类的掺假物或特定蜂蜜品种，缺乏在统一分析框架下对多种糖基掺假物的系统评估。本研究旨在填补这一空白，以巴基斯坦蜂蜜为背景，评估FTIR–ATR光谱结合PCA、PLSR和PLS-DA在检测、区分和定量六种主要糖基掺假物方面的能力。

**关键技术方法**

本研究在巴基斯坦拉合尔兽医与动物科学大学食品安全实验室完成。纯蜂蜜样品采集自巴基斯坦旁遮普省Chichawatni旁遮普森林部门，该区域以多样化花卉植被和活跃养蜂业著称，蜂蜜由蜜蜂在森林生态系统中自然采集多种野生和栽培花卉花蜜酿造而成，代表多花蜂蜜特征。研究采用Bruker ALPHA紧凑型ATR-FTIR光谱仪（配备OPUS 7.5软件和金刚石单反射ATR附件）采集光谱，波数范围为650–4000 cm^?1，分辨率4 cm^?1，每样品扫描24次，每次测量前采集24次背景扫描，以吸光度模式记录，每样品重复测量三次。六种掺假物（果糖糖浆、葡萄糖浆、麦芽糖浆、转化糖浆70% w/w、蔗糖溶液70% w/w、粗糖糖浆70% w/w）分别以1%、5%、10%和20%（w/w）四个水平掺入纯蜂蜜，共制备24个掺假样品，以纯蜂蜜为对照。光谱预处理包括基线校正和Savitzky–Golay二阶导数（二阶多项式、15点窗口）及均值中心化处理。选取碳水化合物指纹区（1500–750 cm^?1）用于化学计量学建模。数据集按分层重复水平划分为校正子集（50条光谱）和保留子集（25条光谱）。采用PCA进行无监督探索性分析，PLS-DA进行有监督分类，PLSR进行各掺假物浓度的独立定量预测。

**研究结果**

**纯蜂蜜FTIR–ATR光谱表征：** 纯蜂蜜在中红外区呈现四个主要吸收区，3269 cm^?1处宽强吸收峰归属O–H伸缩振动，1645 cm^?1处吸收峰归属水分子O–H弯曲振动，2930 cm^?1处弱吸收峰归属C–H伸缩振动。指纹区（1500–750 cm^?1）包含糖类C–O、C–C及环振动/变形振动的重叠吸收带，1024 cm^?1处为全谱最强吸收峰，此外在1343、1254、918、865、817和775 cm^?1处均观察到特征吸收峰。

**不同掺假物溶液FTIR–ATR光谱表征：** 六种掺假物均在3290–3260 cm^?1、2930–2920 cm^?1和1640–1645 cm^?1附近呈现类似吸收带，但在指纹区（1200–750 cm^?1）表现出明显差异。果糖和葡萄糖在1020–1025 cm^?1附近均呈现强吸收，但相对强度不同；转化糖在1104、1021和923 cm^?1处呈现特征吸收；麦芽糖和蔗糖在1110、1045–1048和992–994 cm^?1附近呈现更尖锐的峰形；粗糖糖浆谱带较宽，强度存在差异。

**掺假蜂蜜FTIR–ATR光谱表征：** 掺假样品整体谱形与纯蜂蜜相似，但随着掺假浓度从1%增至20%，在指纹区尤其是1100–1000 cm^?1范围内吸光度呈系统性增强，光谱逐渐向相应纯掺假物谱形偏移，在20%掺假水平时与纯掺假物光谱最为接近。不同掺假物在特定波数处呈现差异化的强度增强模式。

**PCA分析：** PCA得分图显示纯蜂蜜形成紧凑、明确的聚类，掺假样品与其沿PC1轴明显分离。PC1解释总方差的72%–98%。1%和5%掺假样品靠近纯蜂蜜聚类，而10%和20%样品分离程度更大，呈现浓度依赖性分布。二糖类掺假物（蔗糖、麦芽糖）的分离效果优于单糖类（果糖、葡萄糖），可能因其糖苷键结构的额外振动特征增强了指纹区的区分度。

**PLSR定量分析：** 各掺假物独立PLSR模型的校正R²_cal范围为0.9656–1.0000，保留验证R²_pred范围为0.9270–0.9999。转化糖和蔗糖校正性能最佳（R²_cal = 1.0000），麦芽糖预测性能最高（R²_pred = 0.9999，SEP = 0.1342%），其次为转化糖（R²_pred = 0.9990，SEP = 0.2525%）和蔗糖（R²_pred = 0.9976，SEP = 0.4715%）。果糖预测精度相对最低（R²_pred = 0.9270，SEP = 2.0250%），可能因其为蜂蜜天然主要成分而致光谱重叠较大。各模型使用的潜变量数为2至6个。

**PLS-DA分类分析：** PLS-DA模型在校正集中总体样品水平分类准确率为92.0%（46/50），保留验证集为88.0%（22/25），宏平均类别准确率分别为97.71%和96.57%。纯蜂蜜、葡萄糖和蔗糖在两组数据中均实现100%灵敏度、特异度和类别准确率。果糖在两组中灵敏度均为100%，类别准确率为92.00%。转化糖和粗糖在校正集中灵敏度为87.50%、准确率为98.00%，保留验证中灵敏度降至75.00%。麦芽糖在两组中灵敏度均为75.00%、准确率为96.00%。PLS-DA得分图沿第一潜变量（LV1）呈现纯蜂蜜与掺假样品的分离，且随掺假水平升高分离程度增大。

**讨论与结论**

本研究证实，FTIR–ATR光谱指纹区（1500–750 cm^?1）蕴含蜂蜜掺假检测最关键的糖类振动信息，与Damto等人及Sivakesava和Irudayaraj的结论一致。掺假不引入新官能团，仅改变现有碳水化合物组分的相对浓度，导致谱带强度变化而非新峰出现，与Ciurs?等人和Gok等人的发现一致。PLSR模型的预测性能与多项前人研究一致，其R²值普遍超过0.90。PLS-DA在本研究中获得的分类准确率与文献报道的74%–100%区间相符。转化糖、粗糖和麦芽糖的少量误分类可能归因于其化学组成相似导致光谱特征重叠。本研究主要局限包括：基于单一蜜源的实验设计、重复水平而非完全独立样本的验证策略、仅评估单一掺假物而未考察混合掺假情形，以及未系统评估植物源、地理源和采收批次的影响。此外，研究未正式建立检测限和定量限，1%和5%低浓度水平的区分能力相对较弱。

研究结论：FTIR–ATR光谱联用化学计量学分析被证明是一种快速、无损且可靠的方法，可用于蜂蜜中主要糖基掺假物的检测、区分、分类和定量。指纹区（1500–750 cm^?1）为蜂蜜真实性鉴别提供了最相关的光谱信息，PCA、PLSR和PLS-DA在重复水平保留评估中成功区分了纯蜂蜜与六种掺假物样品，模型表现出优异的分类和预测性能。然而，鉴于当前数据集来源于单一蜜源且验证方案存在局限，在推荐常规监管或工业应用前，仍需使用更广泛的蜂蜜品种、地理来源和掺假场景进行独立验证。未来应重点开展涵盖多样蜜源和商业化样本的模型验证研究，以增强模型的稳健性和实际适用性。