构建多尺度功能性血管网络：从生物学原理、设计约束到先进生物制造策略

《Biomimetics》：Engineering Multiscale Vasculature: Biological Principles, Design Constraints, and Advanced Biofabrication Strategies for Functional Vascular Networks

　　

构建功能性多尺度血管网络仍然是组织工程（Tissue Engineering, TE）与再生医学（Regenerative Medicine）领域的重大挑战。天然血管系统涵盖从大型弹性动脉到微米级毛细血管的广泛直径范围，支撑着灌注、屏障调控、力学传导（Mechanotransduction）和免疫监视等关键功能。复制这种复杂性需要能够实现层级分支、维持内皮细胞（Endothelial Cells, ECs）与壁细胞（Mural Cells）表型、并承受生理血流动力学（Hemodynamic）力的生物材料与制造技术。本文结合血管发育生物学，系统综述了生物物理设计约束——包括扩散极限、剪切应力（Shear Stress）、力学顺应性（Mechanical Compliance）及内皮特化，从而勾勒出血管移植物（Vascular Graft）设计的多尺度工程框架。研究人员评估了若干有前景的支架系统，包括电纺纤维（Electrospun Fibers）、脱细胞基质（Decellularized Matrices）、细胞片层构建体（Cell-Sheet Constructs）以及三维（3D）生物打印（3D Bioprinting）方法（如牺牲模板制造（Sacrificial-Template Fabrication）），分别分析了各自的优势、局限性和转化进展。微血管及器官芯片（Organ-on-a-Chip, OOC）模型被评价为研究人类血管生理学与疾病的高保真平台。最后，本文讨论了用于血管化的细胞来源，包括原代内皮细胞和诱导多能干细胞（iPSC）来源的血管谱系，以及用于增强血管成熟的共培养（Coculture）和预处理（Preconditioning）策略。尽管已有文献综述了个别血管生物制造方法，但本文将血管生物学、生物物理设计约束、制造策略及细胞来源在宏观血管和微血管尺度上进行了整合。多尺度方法对于选择并组合满足不同血管特异性要求的技术路径至关重要。综合来看，这些进展有望推动可灌注、稳定且组织特异性的血管网络的发展，并支持多尺度血管移植物向临床应用的转化。

**论文主体内容总结**

**引言**

功能性血管供应的建立对于工程化组织的存活、成熟和整合至关重要。天然血管系统是一个跨越数万英里的复杂分支网络，血管直径从数厘米的大型弹性动脉到小至10–15 μm的毛细血管，体现了对不同器官代谢需求的高度特化结构-功能适应。这种多尺度层级结构在胚胎发生期间通过血管发生（Vasculogenesis）和血管新生（Angiogenesis）形成，并通过内皮细胞（ECs）、壁细胞（平滑肌细胞和周细胞（Pericytes））、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）以及血流动力学力之间的协同相互作用得以维持。工程化复制这种复杂性要求构建物不仅再现物理结构（管腔直径、分支模式和管壁组成），还需具备剪切响应性、屏障调控、血管舒缩张力和免疫相容性等动态特征。由于扩散极限将氧气传输限制在距灌注血管150–200 μm范围内，对于厚度超过数百微米的组织或细胞构建体而言，微血管化是维持其活力的必要条件。为此，多种生物材料和生物制造工艺已得到发展：电纺丝（Electrospinning）可生成模拟天然ECM的纳米纤维支架；脱细胞基质保留了天然血管的生化和力学信号；细胞片层工程（Cell-Sheet Engineering, CSE）可构建富含ECM且具有固有血管化潜力的致密组织；先进3D打印方案能够跨尺度操控血管几何结构；微血管器官芯片系统则作为研究血管生理、疾病和药物反应的高保真平台。与此同时，可用于血管化的细胞来源已从传统内皮细胞拓展至内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells, EPCs）和iPSC来源的内皮及壁细胞谱系，提供了可扩展的患者特异性来源。以往综述多聚焦于单个血管生物制造方法，而对如何选择和组合这些策略以满足不同血管尺度的多样化生物学和生物力学要求关注不足。本综述在血管发育生物学、工程约束、制造策略和细胞来源之间建立多尺度框架，旨在为临床适用的、可灌注且耐久的血管网络开发提供系统指导。

**血管网络的生理学与发育**

血管网络作为机体的中央运输系统，其尺寸跨度极大，从宽度数厘米的主动脉到管腔直径约10–15 μm的毛细血管。这种广泛变异性支撑着不同组织和器官的特化结构、代谢和生物力学功能。天然血管网络在胚胎发生期间通过两个过程形成：血管发生（Vasculogenesis）中，中胚层来源的成血管细胞聚集为血岛，形成原始血管丛；血管新生（Angiogenesis）中，内皮细胞增殖、迁移并侵入ECM，产生具有管腔的芽体，进而延伸形成功能网络。内皮特化、分支形态发生及动静脉身份由VEGF–Notch、血管生成素–Tie2（Angiopoietin–Tie2）和ephrinB2–EphB4信号通路精密调控。ECs构成所有血管的最内层，但依赖壁细胞维持其稳定性和功能：周细胞居留于毛细血管和毛细血管后微静脉，介导基底膜沉积、旁分泌信号转导及内皮屏障完整性调控；在大血管中，血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells, VSMCs）和成纤维细胞组织为同心层结构，赋予血管抗张强度、收缩性和弹性。该结构层级决定了不同的工程化要求——大血管移植物应达到足够的爆破压力和适当的顺应性；微血管构建物则必须具备高分辨率图案化、可控通透性和强大的内皮-周细胞相互作用。

**血管工程的生物学考量**

工程化血管网络受到物质传输、血流动力学功能、内皮稳定性和宿主整合等相互依赖需求的约束。最根本的限制是扩散限制的氧气和代谢物传输：细胞仅能在距灌注血管150–200 μm内存活，超出此距离将发生缺氧、酸中毒乃至坏死。因此，厚度超过数百微米的工程化组织构建体必须整合有序的微血管网络或可灌注通道。工程化血管系统还必须承受血流的生理力学环境：大动脉承受显著的脉动压力，产生大幅动态循环应变；毛细血管压力虽低得多，但仍依赖精细的屏障调控。血流诱导的正常剪切应力在静脉中为1–6 dyn/cm2，动脉中为10–20 dyn/cm2，对调控ECs取向及一氧化氮（Nitric Oxide, NO）生成和抗血栓活性至关重要。非血栓形成性内皮对于灌注构建物不可或缺：缺乏内皮衬里的聚合物或水凝胶介质易促进血小板黏附和血栓形成。此外，ECs的起源显著影响长期功能——动脉、静脉和微血管ECs表现出不同的床特异性表型，屏障特性和血流响应各异。工程化组织在植入后需迅速与宿主血管系统整合：可通过手术吻合（Surgical Anastomosis）直接连接宿主与移植物管腔，或通过内渗连接（Inosculation），即植入构建物内预成形的微血管与向内生长的宿主微血管自发融合。不同器官的血管床存在广泛多样性，如脑微血管建立血脑屏障（Blood–Brain Barrier, BBB）具有紧密的细胞间连接，而肝血窦则拥有窗孔状内皮以利于大分子交换。最后，工程化血管构建物应促进长期重塑而不引发免疫反应，必须在生长、机械应力和损伤的响应中维持结构重塑能力，以反映天然血管的适应性可塑性。

**宏观与微血管移植物设计**

临床对血管移植物的需求涵盖从大口径主动脉置换到小口径冠状动脉或外周血管旁路导管。大口径（>6 mm）移植物中，合成聚合物如涤纶（Dacron，聚对苯二甲酸乙二醇酯）和膨体聚四氟乙烯（ePTFE）已广泛应用于临床，具有持久的长期通畅性和结构稳健性。然而，无生命移植物无法随宿主重塑或生长，尤其在儿科场景中这一局限性更为关键。可生物降解的细胞化大口径移植物通常由聚乙交酯（PGA）或聚己内酯（PCL）聚合物接种自体血管细胞合成，在临床前和早期临床研究中展现出增强的生长和宿主整合能力。小口径（<6 mm）移植物工程化难度更大，因低剪切环境中血栓形成、新生内膜增生和血流功能障碍风险增加，自体大隐静脉和乳内动脉移植物仍是临床金标准。

**电纺支架。** 电纺丝是制造模拟天然ECM纤维结构支架的最通用实用方法之一，可精细控制纤维排列、直径和孔隙率。天然聚合物（胶原蛋白（Collagen）、明胶（Gelatin）、弹性蛋白（Elastin）、壳聚糖（Chitosan））具有高生物活性，支持细胞黏附；合成聚合物（PCL、PLGA、PEUU、PLLA-CL）具有可调的力学性能和耐久性。临床前研究中，电纺移植物已证实可实现血管化、通畅性和重塑。复合支架通过整合混合聚合物或多层结构更贴近天然血管的三层结构，如具有梯度孔隙率的双层PCL/胶原蛋白支架。电纺丝的主要局限性包括致密纤维堆积抑制细胞浸润和营养扩散，以及重塑不完全和免疫相容性问题；通过盐沥滤/低温沥滤、牺牲纤维去除及表面功能化等策略可改善孔隙率和血液相容性。

**脱细胞基质。** 通过脱细胞处理天然血管获得的ECM因保留天然胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖（Glycosaminoglycans, GAGs）和嵌入的细胞因子，成为血管组织工程中极具前景的支架。多种脱细胞策略——物理、化学和渗透处理——可在细胞去除与结构保护间取得平衡。ECM交联可降低免疫原性并增强耐久性。生物反应器中的动态条件化可诱导ECM排列改善、刚度增加和内皮层形成增强。混合支架将脱细胞ECM与合成聚合物或生物活性分子结合以协同增效，如肝素连接的脱细胞胎盘支架在大鼠主动脉植入一个月内展现出高抗血栓形成性、巨噬细胞相容性和近100%的通畅率。然而，脱细胞效率的变异性和灭菌对ECM的损伤仍是重要关切，需在大动物临床前研究中验证长期重塑和免疫相容性。

**细胞片层工程。** 细胞片层工程是一种无支架方法，利用热响应性基底（如聚N-异丙基丙烯酰胺（PIPAAm））实现融合单层细胞的贴壁与脱离。与传统酶解传代破坏细胞间黏附分子和ECM不同，CSE保留了支持细胞-ECM间串扰的天然微环境，这对血管生成潜力尤为重要。由内皮或基质细胞形成的致密连续细胞片层可堆叠或卷绕为多细胞构建物。堆叠的含ECs和基质/SMCs细胞片层已被证明可生成预血管化构建物，促进毛细血管网络形成、宿主血管整合和移植后功能性组织灌注。管状细胞片层基血管移植物通过将多层细胞片层卷绕成血管导管而开发。Elomaa等人将混合GelMA/PCL-MA 3D打印管状支架与HUVEC细胞片层结合，嵌入胶原蛋白水凝胶并与真皮成纤维细胞共培养后，引发了血管生成性出芽和微血管网络发育，持续3周。该系统在动态灌注下通过HUVEC自组织形成致密的有腔微血管，代表了CSE围绕3D打印可灌注血管构建体外可灌注血管床的首批演示之一。CSE的技术瓶颈包括多层片层的放大、血管与实质细胞谱系的整合、片层制造的自动化以及脆弱片层的安全处理和转移。

**3D打印与牺牲模板生物制造。** 3D打印可通过生物材料、细胞和生化信号的精准可编程沉积来工程化复杂血管化组织。挤出式（Extrusion-based）生物打印在血管应用中占主导地位，可打印ECs、SMCs、成纤维细胞和支撑基质以生成模拟内膜、中膜和外膜样结构的多层导管。喷墨式（Inkjet）生物打印在微尺度图案化方面优势突出但受限于细胞密度和生物墨水黏度。激光辅助（Laser-assisted）生物打印可实现单细胞高精度图案化。立体光刻（SLA）和数字光处理（DLP）生物打印可在光交联生物墨水中实现分支可灌注网络的微尺度制造，包括数微米级别的毛细血管尺度特征。牺牲模板生物打印将牺牲材料打印至块状水凝胶基质中，经去除后形成可灌注通道。牺牲墨水按去除机制分类：热、离子、酶、溶剂或化学方式。热响应性聚合物Pluronic F127（PF-127）具有高打印保真度和可逆胶束化特性，可实现三同轴打印，创建具有有序内皮和平滑肌区室排列的复杂可灌注血管类似物。糖玻璃模板（Sugar-Glass Template）源自蔗糖，提供刚性结构、高分辨率和快速溶解相，可获得内皮种植效率高的洁净微通道。SWIFT（牺牲书写入功能性组织）方法利用嵌入式3D打印配合牺牲墨水，制造出可灌注、内皮衬里的多尺度血管通道，所产生的心脏组织构建物在7天内融合并表现出同步搏动。

**微血管芯片。** 微血管芯片（Microvasculature-on-a-Chip, MOC）和器官芯片（OOC）平台利用微流控、多细胞共培养、组织特异性ECM和生物力学信号来模拟人类微血管的形态与功能。制造方法包括软光刻（Soft Lithography）、黏性指进图案化（Viscous Finger Patterning）、牺牲成型（Sacrificial Molding）和水凝胶模板化（Hydrogel Templating）。此类装置通常包含10–150 μm的可灌注微通道，内衬ECs并施加可控剪切应力（~1–10 dyn cm^?2）。微生理模型将ECs和周细胞嵌入胶原蛋白、纤维蛋白（Fibrin）或Matrigel基质中，以研究出芽式血管新生、套叠式血管新生和内渗连接，能更精确地再现扩散主导的传输和毛细血管尺度的血管重塑。混合架构将图案化微流控通道与自维持微血管整合，实现动态流动下的血管生成出芽、内皮屏障功能和免疫细胞运输。应用领域包括神经血管事件建模（尤其是BBB和卒中病理生理学）、血管新生与抗血管新生治疗筛选，以及免疫-血管相互作用分析。整合患者来源iPSCs可提高生理相关性并实现个性化药物反应谱分析。先进的血管芯片（Vessel-on-a-Chip, VoC）搭载ECs、周细胞和星形胶质细胞，其屏障完整性较仅含内皮系统高出两个数量级以上。糖尿病微血管病芯片可反映基底膜增厚、炎症激活和NO生物利用度降低等血管缺陷；心脏芯片模型则整合心肌细胞代谢耦合与血流响应性氧化应激调控。

**血管化的细胞来源**

**内皮细胞来源。** 原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人真皮微血管内皮细胞（HDMVECs）最常用，但作为终末分化细胞，其增殖潜力有限且供体间变异性高。内皮祖细胞（EPCs），包括晚期生长内皮集落形成细胞（ECFCs），具有高克隆形成和血管生成潜力，可从外周血或脐带血中分离并在体内形成稳定的可灌注血管。脐带血来源的ECFCs比成人内皮来源具有更强的增殖和网络形成潜力及更低的免疫原性，是预血管化构建物的独特内皮来源。iPSC来源的内皮细胞（iPSC-ECs）可有效分化为ECs，再现NO生成、低密度脂蛋白（LDL）摄取和内皮管形成等核心功能，其自体性质降低免疫排斥风险，但遗传稳定性、表观遗传记忆和残余多能性风险限制了其临床应用。CD157⁺亚类iPSC-ECs具有显著优越的血管生成潜力，表明iPSC来源EC群体中可能存在内皮干细胞样细胞。

**支持细胞。** 周细胞包裹毛细血管和毛细血管后微静脉，参与基底膜沉积、血管稳定化和内皮通透性调控，保护血管免受力学和炎症应激。壁细胞来源的基质结合VEGF对内皮形态发生和管腔形成不可或缺，这一过程无法仅凭可溶性VEGF模拟。壁细胞还通过PDGFRβ、TGF-β和Ang1–Tie2信号通路诱导内皮静息并抑制异常出芽。VSMCs是动脉壁中的主要收缩细胞，提供血管顺应性并调控血管反应性。间充质干/基质细胞（MSCs）通过旁分泌促血管生成信号（如VEGF、PDGF-BB）支持向周细胞或平滑肌样表型分化；MSC组织来源（如骨髓vs.脂肪）显著影响微血管网络的成熟和功能。

**共培养策略。** 血管化的可行性和耐久性通常需要内皮与壁细胞谱系的共培养。ECs与壁细胞比例以1:1至3:2常见，最佳比例取决于细胞类型和基质环境。在3D纤维蛋白构建物中，ECs与基质/MSC群体的共培养支持同步的成骨和血管生成，预血管化网络随时间持续存在和更新。共培养细胞间存在双向益处：ECs与MSCs在3D软骨内成骨类器官中共培养可促进更好的血管化和后续组织再生；MSCs在细胞球体中为ECFCs提供营养和保护支持，显著改善体内存活和血管生成植入效果。除细胞组织方式外，培养基组成和培养条件亦关键：优化的生化环境可降低对外源性生长因子（如VEGF）高水平的依赖。此外，生理相关力学约束下共培养ECs和SMCs可改善两种细胞类型的自发正交排列，模拟天然血管形态。

**未来方向**

血管生物制造的未来进展需在生物学性能和制造方面同时取得突破。对于跨血管长度尺度组合多种细胞群体和多样生物材料的构建物，可放大生产仍具挑战性。需建立功能性性能检测标准以规范身份、纯度、无菌效力和批间一致性。监管策略须考虑此类组合产品的特殊性——其在基于装置的制造流程中整合了活细胞、可降解生物材料和生物活性因子。人工智能和计算方法可借助实验、成像和工艺数据辅助优化打印参数、血管几何结构、生物墨水组成和灌注条件。响应力学、生化或细胞信号的智能生物材料可实现可控降解、生长因子呈递与释放、内皮化和重塑。临床转化最终需要将这些进展与可扩展的细胞来源、自动化封闭式制造工作流程、长期体内验证、可靠的宿主整合和明确界定的放行标准相结合。

**结论**

功能性多尺度血管网络的工程化构建仍是组织工程和再生医学中关键而复杂的挑战。通过多样化的方法——包括电纺支架、脱细胞基质、细胞片层工程、先进3D生物打印和牺牲模板制造——已取得重大进展，每种方法针对血管结构和功能的不同方面。成功的血管化需整合层级架构、稳定内皮化、壁细胞支持以及生理相关的力学和生化信号。同时，细胞来源方面的进展，尤其是内皮祖细胞和iPSC来源血管谱系的发展，加之优化的共培养和预处理策略，显著提升了血管稳定性、灌注和宿主整合能力。微血管和器官芯片平台通过实现人类血管生理和疾病的高保真建模，进一步推动了该领域发展，为机制研究和治疗发现提供了强大工具。然而，临床转化的主要障碍包括：可重复且可放大的制造（需要可靠的毛细血管尺度网络制造和成熟）；植入后性能的改善（需要免疫相容性、可复现的宿主吻合或内渗连接、重塑后长期通畅性的保持以及组织特异性内皮表型的维持）；监管标准的建立和满足（需要标准化质量控制检测和针对复杂细胞-生物材料组合产品的监管路径）。血管生物学、生物材料科学、干细胞工程、生物制造和转化制造的进展必须精心协调，以生产能够维持体内功能性灌注的临床可行构建物。